Elaboração de Multiplex-PCR para pesquisa de genes associados à resistência antimicrobiana em enterobactérias

Abstract

A avicultura é um dos principais segmentos do setor agropecuário no Brasil. O país é o maior exportador e o terceiro maior produtor de carne de frango. As enterobactérias são comumente isoladas em infecções na indústria avícola e geram prejuízos direta e indiretamente. Para o controle dessas bactérias, antimicrobianos são frequentemente utilizados como terapêuticos e como promotores de crescimento. Esses fármacos são administrados durante várias fases do ciclo de produção e podem acarretar problemas à saúde pública, como toxicidade, alergia e desenvolvimento de bactérias resistentes. Os mecanismos de resistência podem ser disseminados horizontalmente, através da transferência de genes entre as bactérias. A resistência antimicrobiana emergente em enterobactérias é um problema significante que vem mobilizando a comunidade científica em todo o mundo. As pesquisas de genes associados a essa resistência têm aumentado a compreensão dos fatores envolvidos e auxiliado na formulação de estratégias para o uso prudente dos agentes antimicrobianos. Para detecção de múltiplos genes simultaneamente, a técnica de multiplex-PCR mostra-se uma ferramenta rápida e eficiente, tanto para o diagnóstico clínico como em pesquisas científicas. O objetivo deste trabalho foi elaborar quatro protocolos de multiplex-PCR para detectar 11 genes associados à resistência antimicrobiana em enterobactérias. O presente estudo foi conduzido no Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA), na Faculdade de Veterinária, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), em Porto Alegre. Dez amostras de Salmonella spp. foram utilizadas como controles positivos. Dois pares de primers, foram usados para amplificação dos genes que codificam β-lactamases (blaTEM e blaPSE-1) simultaneamente. A presença dos genes codificadores da bomba de efluxo das tetraciclinas (tetA, tetB, e tetG); da enzima estreptomicina fosfotransferase (strA e strB); da proteína transportadora não-enzimática de cloranfenicol (cmlA) da proteína exportadora de florfenicol (floR); da dihidropteroato sintetase tipo I (sulI); e da dihidropteroato sintetase tipo II (sulII) foi determinada a partir do agrupamento de protocolos de PCR previamente estabelecidos em trabalhos publicados. Ajustes foram feitos nos componentes da reação e a temperatura de anelamento foi otimizada para cada grupo de primer, permitindo assim o êxito na amplificação dos segmentos esperados. O presente projeto está inserido em uma importante linha de pesquisa do grupo que avalia a resistência antimicrobiana de enterobactérias a partir da associação de diferentes parâmetros (perfil genético, testes bioquímicos, antibiogramas e inteligência artificial).

The poultry industry is one of leading segment of the agricultural sector in Brazil. The country is the largest exporter and third largest producer of chicken meat. Enterobacteria are commonly isolated from infections in the poultry production and generate direct and indirect losses. To control these bacteria, antibiotics are often used as therapeutic and as growth promoters. These drugs are administered during various phases of the production cycle and may lead to health problems such as toxicity, allergy and development of resistant bacteria. Resistance mechanisms can be spread horizontally through gene transfer among bacteria. Antimicrobial resistance emerging in enterobacteria is a significant problem that has been mobilizing the scientific community around the world. The researches associated with these resistance genes have increased the understanding of the factors involved and assisted in the formulation of strategies for the prudent use of antimicrobial agents. For detection of multiple genes simultaneously, the technique of multiplex-PCR is shown a fast and efficient tool for both clinical diagnosis and scientific research. The aim of this study was to develop four protocols of multiplex-PCR for 11 genes associated with antimicrobial resistance in enterobacteria. This study was conducted at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA), na faculdade de Veterinária, na Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre. Ten samples of Salmonella spp. were used as positive controls. Two pairs of primers were used for amplification of the genes encoding β-lactamases (blaTEM and blaPSE-1) simultaneously. The presence of genes encoding the tetracycline efflux pump (tetA, tetB and tetG); enzyme streptomycin phosphotransferase (strA and strB); transporter protein nonenzymatic chloramphenicol (cmlA) protein exporter of florfenicol (floR); the dihydropteroate synthetase type I (sulI) and dihydropteroate synthase type II (sulII) was determined from the grouping of PCR protocols previously established in published works. Adjustments were made in the components of the reaction and the annealing temperature was optimized for each group of primer, allowing the successful amplification of segments expected. This project is part of a research line from the group that evaluates antibiotic resistance of enterobacteria from the association of different parameters (genetic profile, biochemical tests, antibiograms and artificial intelligence).