Padronização da clonagem da subunidade AgB8/1 do antígeno B de Echinococcus granulosus em vetor para expressão na levedura Pichia pastoris

Abstract

O Echinococcus granulosus é um helminto parasita pertencente à Classe Cestoda. O desenvolvimento da fase larval (cisto hidático) de E. granulosus nas vísceras dos hospedeiros intermediários é responsável pela doença hidatidose cística. O cisto consiste em uma estrutura unilocular preenchida pelo líquido hidático, o qual contém os produtos de secreção/excreção do parasito, sendo o antígeno B (AgB) a principal proteína secretada. O AgB é uma lipoproteína oligomérica formada por subunidades de 8 kDa codificadas por uma família multigênica com pelo menos cinco genes identificados (EgAgB8/1-EgAgB8/5). O antígeno B (AgB) tem sido descrito como envolvido em diversos mecanismos da interação parasito-hospedeiro que promovem o estabelecimento e a sobrevivência do parasito no hospedeiro intermediário. A presença de grandes quantidades de AgB no líquido hidático sugere um importante papel na biologia do parasito. A levedura Pichia pastoris constitui um dos sistemas mais utilizados e bem sucedidos para a expressão heteróloga de proteínas, seja para emprego em pesquisa, seja para produção industrial. Uma grande vantagem de P. pastoris sobre sistemas de expressão bacterianos é que a levedura tem potencial para realizar muitas das modificações pós-traducionais tipicamente associadas com eucariotos superiores. Neste trabalho, foi realizada a padronização da amplificação da sequência codificadora da subunidade AgB8/1 por PCR e a preparação do vetor de expressão pPICZαC, de P. pastoris, para a clonagem. A sequência codificante de AgB8/1 foi amplificada por uma PCR primária e o produto dessa reação foi utilizado como molde para uma PCR secundária, a partir da qual se obteve um fragmento de 292 pb que, posteriormente, será utilizado para a clonagem por recombinação homóloga in vivo. A partir da obtenção do clone, serão padronizadas a expressão na levedura P. pastoris e a purificação da proteína recombinante para utilização em estudos estruturais e funcionais.

Echinoccocus granulosus is a helminth parasite belonging to the class Cestoda. The development of the larval stage (hydatid cyst) of E. granulosus in the viscera of the intermediate hosts is responsible for cystic hydatid disease. The cyst consists in a unilocular structure, filled by hydatid fluid which contains the parasite excretory/secretory products, antigen B (AgB) being the main secreted protein. The AgB is an oligomeric lipoprotein formed by 8 kDa subunits, encoded by a multigene family with at least five genes identified (EgAgB8/1-EgAgB8/5). Antigen B has been described as involved in various mechanisms of host-parasite interactions that promote the establishment and survival of the parasite in the intermediate host. The presence of large amounts of AgB in hydatid fluid suggests an important role in the parasite´s biology. The yeast Pichia pastoris is one of the most widely and successfully used systems for heterologous protein expression, either in research or in industrial production. A major advantage of P. pastoris over bacterial expression systems is that the yeast has the potential to perform many of the post-translational modifications typically associated with higher eukaryotes. In this work, the procedures for the AgB8/ 1 subunit coding sequence amplification by PCR and preparation of pPICZαC expression vector, from P. pastoris, for cloning were standardized. The AgB8/1 coding sequence was amplified by primary PCR and the product of this reaction was used as template for secondary PCR, from which it was obtained a 292 bp fragment, that subsequently will be used for cloning by in vivo homologous recombination. The obtained clone will be used to standardize the expression and purification of the recombinant protein in yeast P. pastoris for use in structural and functional studies.