Efeito da hipóxia sobre a expressão proteica de Cryptococcus gattii

Abstract

A levedura Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose, doença que pode levar à infecção fatal no sistema nervoso central em humanos e outros mamíferos. A forma de infecção ocorre através da inalação de esporos fúngicos pelas vias aéreas superiores e atinge os pulmões dando início à formação de sítios de deposição fúngica (criptococoma). Os níveis de oxigênio nos criptococomas são reduzidos devido à diminuição da perfusão sanguínea no local, ocasionando hipóxia (0,5-5% oxigênio) ou anóxia (0% oxigênio). Nesses sítios, o fungo não só modula seu metabolismo energético de acordo com a disponibilidade de oxigênio como também de nutrientes que o tecido dispõe. O oxigênio molecular (O2) é essencial para a produção de trifosfato de adenosina (ATP) na respiração celular e nas vias bioquímicas relacionadas à biossíntese de ácidos graxos insaturados, tirosina, esteróis e ácido nicotínico para a fosforilação oxidativa e processos biossintéticos. Desse modo, o oxigênio é um elemento essencial para a manutenção do patógeno aeróbico no hospedeiro. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar o efeito da hipóxia sobre a expressão global das proteínas de C. gattii. Para isso, a levedura foi cultivada em YNB líquido a 37ºC em concentração de O2 ajustada para 1% (V/V). As células foram coletadas em três tempos diferentes de hipóxia (0h-T0, 24h-T24 e 48h-T48) e as proteínas extraídas foram separadas por SDS-PAGE. Cada canaleta do gel foi dividida em 9 frações, as quais foram submetidas à tripsinização. Os peptídeos eluídos foram separados por cromatografia líquida e analisados por espectrometria de massas. Foram consideradas identificações válidas as proteínas que apresentassem pelo menos 2 peptídeos únicos, nas quais aparecessem em no mínimo 2 replicatas biológicas. Nas condições analisadas, foi possível identificar 130 proteínas, tendo sido identificadas proteínas expressas somente em uma determinada condição (43 proteínas em T0, 14 em T24 e 13 em T48). Com os resultados proteômicos analisados, pôde-se observar que houve a regulação positiva ou negativa da expressão protéica de C. gattii na situação de hipóxia. Devido ao fato da hipóxia ocorrer comumente no ambiente da infecção fúngica, o remodelamento metabólico ao qual o fungo se submete é crucial para a sua proteção e manutenção in vitro ou no hospedeiro. Em análises fenotípicas realizadas neste trabalho, verificou-se que a hipóxia pode exercer influência no crescimento fúngico e na sua melanização, porém não foi possível verificar aumento na espessura da cápsula. Adicionalmente, observou-se modificações na regulação da expressão protéica nas vias metabólicas glicolítica, pentose-fosfato, glioxalato, ácido tricarboxílico, fosforilação oxidativa entre outras. Essa alteração entre as via metabólicas pode ser o resultado de uma compensação pela redução do aporte de oxigênio para dentro da célula fúngica.

The yeast Cryptococcus gattii is the etiologic agent of cryptococcosis, a disease that can led to fatal infection of the central nervous system in humans and other mammals. The form of infection occurs through inhalation of fungal spores through the upper airways and reaches the lungs initiating the formation sites of fungal deposition (crytococcoma). Cryptococcomas experience low oxygen levels in the lungs causing hypoxia (0.5-5 % oxygen) or anoxia (0 % oxygen). At these sites, the fungal cells not only modulates its energy metabolism according to the availability of oxygen but also to the nutrients that the tissue has. The molecular oxygen is essential for the production of adenosine triphosphate (ATP) in cell respiration and the biochemical pathways related to the biosynthesis of unsaturated fatty acids, tyrosine, sterols and nicotinic acid for oxidative phosphorylation and biosynthetic processes.Thus, oxygen is essential for the maintenance of aerobic pathogen in host environment. So, the aim of this study is to analyze the effect of hypoxia on the global expression of proteins of C. gattii. For that reason, yeast was grown in liquid YNB 37ºC with reduced O2 levels (1% - V/V). Cells were collected at three different periods of hypoxia (0h-T0, 24h-T24, 48h-T48) and the extracted proteins were separated by SDS-PAGE. Each gel lane was divided into 10 slices and digested with trypsin. The eluted peptides were separated by HPLC and analyzed by mass spectrometry. Only proteins identifications with at least 2 unique peptides and present in at least two biological replicates were considered true identifications. In the conditions analyzed, a total of 130 proteins could be identified, with several presenting the expression in specific conditions (fourty-three proteins in T0, fourteen in T24 and thirteen in T48). With the proteomic results analyzed, it was observed that there was a positive or negative regulation of protein expression of C. gattii in the situation of hypoxia. Because of hypoxia occur commonly in the environment fungal infection, metabolic remodeling to which the fungus undergoes is crucial for their protection and maintenance in vitro or in the host. The phenotypic analyzes showed that hypoxia can exert influence on fungal growth and their melanization, but this work did not observed increase in the thickness of the capsule. In addition, we observed changes in the regulation of protein expression, pentose-phosphate, glyoxylate, tricarboxylic acid, oxidative phosphorylation and other glycolytic pathways. This change between the metabolic pathway may be the result of a compensation for reduced oxygen supply into the fungal cell.