Caracterização de mutações associadas com a resistência à pirazinamida e etambutol em isolados de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose.

Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.