Identificação e caracterização de genes de resistência a Pythium dissotocum em arabidopsis e tomate

Abstract

As plantas expressam diferentes mecanismos de defesa em resposta a patógenos. Em geral, ocorre o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) por receptores específicos das plantas, desencadeando as respostas de defesa através das vias de sinalização mediadas por jasmonato (JA), etileno (ET) e ácido salicílico (AS). Além disso, a descoberta de sinais endógenos como AtPep1 que regulam a expressão de genes de defesa em Arabidopsis thaliana tem auxiliado na compreensão dos mecanismos de defesa. No entanto, os mecanismos de defesa de plantas a patógenos necrotróficos como Pythium spp. são pouco conhecidos. Desta forma, o desenvolvimento de estratégias para identificar e caracterizar genes de resistência à Pythium spp. pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de defesa, possibilitando a obtenção de cultivares resistentes. Uma das estratégias empregadas para a identificação de genes de resistência a patógenos do gênero Pythium consistiu na construção de uma biblioteca de cDNAs diferencialmente expressos em A. thaliana susperexpressando AtPROPEP1, que são mais resistentes à P. irregulare e a P. deliense. Paralelamente, foi realizada a busca de um gene ortólogo ao AtPROPEP1 de A. thaliana em diferentes espécies de solanáceas. Outra estratégia utilizada envolveu a avaliação do efeito da aplicação dos hormônios JA e AS e do regulador de crescimento etefon na resistência de plantas de tomate à P. dissotocum. Posteriormente foi realizado o silenciamento dos genes CTR1, ERF1 e SlPROPEP em plantas de tomate a fim de verificar o papel dos mesmos na resistência das plantas à P. dissotocum. Os resultados obtidos na biblioteca subtrativa indicam que A. thaliana superexpressando AtPROPEP1 pode induzir a expressão não somente da defensina PDF1.2, mas também de GRP3, outro gene envolvido na defesa de plantas contra patógenos. Através da busca de ortólogos de AtPROPEP1 em diferentes solanáceas foi possível identificar um ortólogo em Solanum lycopersicum - SlPROPEP. O tratamento com etefon aumentou a resitência das plantas à P. dissotocum comparado com as plantas não tratadas. Este tratamento também induziu a expressão relativa de SlPROPEP, PR-1, PR-5 e da defensina DEF2. Assim como o tratamento com etefon o silenciamento do gene CTR1, que atua como um regulador negativo da via de sinalização de defesa por ET aumentou a resistência das plantas à P. dissotocum. Enquanto que as plantas silenciadas para os genes ERF1 e SlPROPEP foram mais suscetíveis. O silenciamento de SlPROPEP reprimiu a expressão relativa dos genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 envolvidos na defesa de plantas à patógenos. Estes resultados, em conjunto com o aumento da resistência nas plantas tratadas com etefon, sugerem que a via de sinalização de ET atua na resistência de tomate à P. dissotocum sendo que esta resistência possivelmente é mediada por SlPROPEP.

Plants express different defense mechanisms in response to pathogens. In general, specific receptors in plants reconize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), triggering the response defenses by signaling pathways mediated by jasmonate (JA), ethylene (ET) and salicylic acid (SA). Furthermore, the discovery of endogenous signals, as AtPep1, which regulate defense genes expression in Arabidopsis thaliana, has aided the understanding of the defense mechanisms. However, the defense mechanisms of plants to necrotrophic pathogens such as Pythium spp. are poorly known. Thus, development of strategies to identify and characterize the resistance genes to Pythium spp. can help the understand of defense mechanisms, allowing the obtainance of resistant cultivars. One of the strategies used for the identification of resistance genes to pathogens within the genus Pythium consisted to construct a cDNA library of differentially expressed genes in plants overexpressing AtPROPEP1, which are more resistant to P. irregulare and P. deliense. Simultaneously, a search for orthologous genes to AtPROPEP1 from A. thaliana in different species of Solanaceae was performed. Another strategy used involved the evaluation of application of JA and AS and of the growth regulator ethephon on the resistance of tomato plants to P. dissotocum. Then, the silencing of the genes CTR1, ERF1 and SlPROPEP was performed in tomato plants in order to check the role of the tomato resistance to P. dissotocum. The results obtained from subtractive cDNA library indicate that A. thaliana plants overexpressing AtPROPEP1 may induce expression not only of the PDF1.2 defensin but also the GRP3 expression, another gene involved in plant defense against pathogens. By the search for orthologous genes to AtPROPEP1 in different species of Solanaceae was possible to identify an ortholog in Solanum lycopersicum - SlPROPEP. The ethephon treatment increased resistance of plants to P. dissotocum compared to untreated plants. This treatment also induced the expression of SlPROPEP, PR-1, PR-5 and DEF2 defensin. As ethephon treatment, the silencing of CTR1 gene, which acts as a negative regulator of defense signaling pathway by ET, increased plant resistance to P. dissotocum. Whereas the plants containing ERF1 and SlPROPEP genes silenced were more susceptible. SlPROPEP silencing repressed the relative expression of the genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 involved in plant defense to pathogens. These results, together with increased resistance in the plants treated with ethephon, suggest that ET signaling pathway acts in tomato to resistance P. dissotocum and this resistance is likely mediated by SlPROPEP.