Cultivo in vitro em well-of-the-well de embriões quimeras de mus musculos domesticus

Abstract

O desenvolvimento in vitro de quimeras a partir da agregação de diferentes massas celulares embrionárias, produzindo um único indivíduo com duas ou mais linhagens celulares, é uma técnica que pode ser empregada na produção de clones. O experimento teve como objetivo comparar a eficiência do cultivo in vitro (CIV) de quimeras pelo sistema Well-of-the- Well (WOW) modificado por Feltrin et al. (2006) com o sistema de microgotas (PEURA et al., 1998). Fêmeas da espécie Mus musculos domesticus, da linhagem CF1 suiça Albina, foram induzidas à superovulação e após acasaladas com machos inteiros. Quarenta e oito horas após a observação do tampão vaginal foi realizada a coleta dos embriões nos estádios de quatro, oito e 16 células. Os embriões, com exceção do grupo controle, foram expostos a enzima pronase 26 UI/mL diluída em PBSm, para a remoção da zona pelúcida (ZP). O CIV foi realizado em meio KSOM suplementado com 0,4% de BSA, durante 72 h. No Grupo 1 (G1) pares de embriões (n= 67 pares) sem ZP foram cultivados em microgotas de 10 μL de meio; no Grupo 2 (G2) pares de embriões (n= 69 pares) sem ZP foram submetidos ao CIV pelo sistema WOW modificado, no qual os micropoços foram produzidos manualmente dentro de poços de placas de quatro poços contendo 500 μL de meio; finalmente dez embriões em média por replicação do grupo controle (GC), com a zona pelúcida intacta, foram cultivados em gotas de 100 μL de meio. Os resultados de seis replicações foram analisados aplicando-se o teste do χ 2, para P<0,05. Os dados revelaram diferença significativa entre os grupos 1 e 2 nas taxas de agregação de massas celulares: G1= 58% (39/67) e G2= 83% (57/69). As taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto apresentaram diferenças significas entre os três grupos: G1= 43% (29/67), G2= 66% (46/69) e GC= 92% (55/60). O sistema de cultivo WOW modificado é mais eficiente para a produção in vitro de quimeras de embriões Mus musculos domesticus que o cultivo em microgotas.

The in vitro development of aggregates embryos (chimeras) of different embryonic cell masses, producing just one individual with two or more cell lines is a technique that can be used to improve mammalian clone production. Thus, this experiment was design to compare the efficiency of Mus musculus domesticus embryo chimeras production by in vitro culture (IVC) using the Well-of-the-Well (WOW) modified system (FELTRIN et al., 2006) with the system of microdroplets (PEURA et al., 1998). Mice females, strain CF1 Swiss Albino were induced to superovulation and mated with fertile males. The embryos at development stages of 4, 8 and 16 cell were collected 48 h after vaginal plug observation. The embryos of experimental groups were first exposed to the enzyme pronase (26 UI/mL PBSm), to remove the zona pellucida (ZP), and then transferred to KSOM medium supplemented with 0,4% BSA under mineral oil, in a humid gaseous atmosphere of 5% CO2 in air at 37°C during 72 h for IVC. Group 1 (G1): embryos pairs (n= 67) without ZP were cultured in microdroplets of 10 μL of medium; Group 2 (G2): embryos pairs (n= 69) without ZP were cultured in WOW modified system, which manually produced microwells, using four wells plates containing 500 μL of medium; Control group (CG): embryos (average of 10 per replication) with intact zona pellucida were cultivated in drops of 100 μL of medium. The results of six replicates were analyzed by χ2 test (P <0.05). The rates of cellular masses aggregation shows a significant difference between G1= 58% (39/67) and G2= 83% (57/69). The embryo development rates to the blastocyst stage differ significantly among the three groups: G1= 43% (29/67), G2= 66% (46/69) and GC= 92% (55/60). The WOW modified embryo culture system is more efficient to produce in vitro mice chimeras than the microdroplets system.