O operon fixABCX de Azospirillum brasiliensis Sp7 é regulado por um promotor dependente de NifA e codifica polipeptídeos homólogos aos produtos dos genes ETF's

Abstract

O processo de fixação biológica do nitrogênio permite que este composto, inacessível na sua forma molecular (N2), possa ser incorporado pelos vegetais e por outros organismos que destas plantas se alimentarem. Esse processo é realizado por microrganismos especializados chamados diazotróficos. Fazendo parte desse grupo estão as bactérias do gênero Azospirilium. Para realizar a transformação do N2 em formas quimicamente reativas (por exemplo, amônia), esses microrganismos utilizam o sistema enzimático da nitrogenase. Este sistema é bastante complexo e depende da ativação coordenada de diversos genes, entre eles os genesfixABCX. Em A. brasilense, estes 4 genes formam um único operon e são transcritos conjuntamente. A região promotora desse operon possui elementos que estão presentes em todos os genes que participam do processo de fixação biológica do nitrogênio, destacando-se: 3 seqüências chamadas UAS (upstream activator sequence) que servem para ancoragem da proteína ativadora NifA, um sítio de ligação para a proteína IHF (integration host jàctor) e um elemento promotor nas posições - 2'4 (GG) e - 12 (GC), local de ligação da RNA polimerase complexada com o fator sigma alternativo ( cr54 ) . Além destas seqüências, há um possível elemento promotor na posição -35/-10, que pode ser reconhecido pelo fator cr70 de Eschen chw co/i. Para verificar a atividade da região reguladora do operonfaABCX, foi realizado, neste trabalho, a fusão entre a região promotora e o gene-repórter lacZ. Para tanto, a região promotora (contendo alterações nucleotídicas no sítio de reconhecimento para o fator cr70 de E. co/i) foi isolada pela reação em cadeia da polimerase (PCR), gerando um fragmento de 273 pares de bases, que foi clonado no vetor pMC1403, gerando o recombinante pMCpfixmut. Para testar a necessidade da presença da proteina NifA na ativação da transcrição, o plasmídeo recombinante foi transformado em linhages de E. co/i MCl 061 contendo ou não o plasmideo pCK3, que expressa constitutivamente a proteína NifA de Klebsiel/a pneumoniae. Foi demonstrado que o promotor do operonjlxABCX segue o sistema de regulação encontrado em outros genes nifou[LX, ou seja, somente é ativo na presença da proteína NifA. Através da elevada homologia entre as proteínas FixABCX com flavoproteínas transportadoras de elétrons eucarióticas e procarióticas, também foi possível sugerir que estes quatro genes desempenhem uma função ·relacionada ao transporte de elétrons para o processo de fixação biológica do nitrogênio.