Caracterização funcional das enzimas do tipo diacilglicerol acetiltransferase (DAcT) e diacilglicerol aciltransferase solúvel (DGAT3) de mamona (Ricinus communis)

Abstract

Triacilgriceróis (TAGs) são a principal forma de estoque de lipídeos em sementes de plantas. As propriedades químicas dos TAGs dependem da composição de seus ácidos graxos. As Diacilglicerol Aciltransferases (DGATs) são as principais enzimas para a biossíntese de TAGs e catalisam a condesação de diacilglicerol (DAG) com ácidos graxos para a formação do principal componente dos óleos vegetais, os TAGs. Diferentes tipos de genes de DGATs (nomeados como DGAT1, DGAT2, DGAT3 e DAcT) têm sido identificados em plantas. DGAT1 e DGAT2 são bem caracterizados, mas pouco é sabido sobre a DGAT3 e a DAcT na maioria das espécies. O entendimento da via enzimática da biossíntese de TAGs, e sua regulação em plantas, é importante para ajudar a melhorar o conteúdo de óleos nutricionais e industriais. O óleo de mamona (Ricinus communis) possui altos níveis de ácido ricinoléico, um ácido graxo “não usual” com características únicas que o tornam interessante para a indústria. Este trabalho objetivou caracterizar os genes de DGAT3 e DAcT em mamona . Foram identificados quatro diferentes genes homólogos da DAcT (DAcTA, DAcTB, DAcTC e DAcTD) e um homólogo para DGAT3 em mamona. Foram caracterizados os padrões de expressão de DGAT3 e DAcTA por meio de RT-qPCRem 5 diferentes estágios do desenvolvimento da semente de mamona, onde foi verificado que DGAT3 é expresso; entretanto, não foi possível identificar expressão considerável das DAcTs no desenvolvimento da semente de mamona. Através da expressão em protoplastos de folhas de Arabidopsis thaliana de fusões traducionais a YFP, tanto a DGAT3 quanto a DAcTA foram visualizadas em microscópio confocal para identificar sua localização subcelular. A DAcTA parece se comportar igual as outras DGATs, associando-se a membranas do retículo endoplasmático; porém, DGAT3 pareceu ter uma localização diferente das outras DGATs, que foi confirmada como citoplasmática. Linhagens de A. thalianaexpressando RcDGAT3-CFP foram obtidas. Sementes T3 homozigotas dessas plantas foram coletadas para caracterização qualitativa de lipídeos neutros, via cromatografia gasosa (GC-FID). Quando expressas em leveduras mutantes, incapazes de produzir triglicerídeos, tanto DAcTA quanto DGAT3 foram capazes de complementar parcialmente a síntese de TAGs, demonstrando sua atividade bioquímica na síntese de lipídeos. A análise qualitativa por espectrometria de massas destes TAGs produzidos nas leveduras possibilitará uma melhor caracterização do papel destas enzimas no metabolismo lipídico. Este trabalho visou contribuir com o entendimento da síntese do óleo em mamona.

Triacylglycerides (TAGs) are the main seed storage lipids in plants. The chemical proprieties of TAGs rely on their fatty acid composition. Diacylglycerol Acyltransferases (DGATs) are the main enzymes for TAG biosynthesis as they catalyze the condensation of diacylglycerol (DAG) to fatty acids for the formation of TAGs. Different types of DGAT genes (named as DGAT1, DGAT2, DGAT3 and DAcT) have been identified in plants. DGAT1 and DGAT2 are well characterized, but little is known about DGAT3 and DAcT in most plant species. The understanding of enzymatic steps for TAG biosynthesis and their transcriptional regulation in plants is important to help to improve the content and the composition of nutritional and industrial oils. The castor bean (Ricinus communis) oil contains high levels of ricinoleic acid, a “not usual” fatty acid with unique characteristics that make it interesting for industry purposes. The aim of this work was to characterize the DGAT3 and DAcT genes in castor bean . This work identified four different DAcT homologs (DAcTA, DAcTB, DAcTC and DAcTD) and one DGAT3 homolog in castor bean. The patter of expression of castor bean DGAT3 and DAcTA were characterized by RT-qPCRover 5 different seed development stages, where it was verified that DGAT3 is actively expressed; however, it was not possible detect significant DAcT expression throughout castor bean seed development. Via transient expression in protoplasts from Arabidopsis thaliana leaves, the fusion proteins DAGT3-YFP and DAcTA-YFP were analyzed by confocal microscopy to access their subcellular localization. DAcTA seems to behave as the other DGATs, associated to the endoplasmic reticulum membranes; yet, DGAT3 seems to localize in a different manner of the others DGATs, which was confirmed as cytoplasmic. Transgenic A. thaliana lines expressing RcDGAT3-CFP were obtained. Homozygous T3 seeds of these plants were harvested and their neutral lipids qualitatively characterized through gas chromatography (GC-FID). When expressed in mutant yeasts that are unable to produce TAGs, both DAcT and DGAT3 were able to partially rescue the TAG synthesis, displaying their biochemical activity on lipids synthesis. The qualitative analysis, through mass spectrometry, of the TAGs produced by the yeasts will enable a better characterization of the role of these enzymes on lipid metabolism. This work aimed to contribute to the understanding of the oil biosynthesis in castor bean.