Análise do padrão de expressão de microRNAs e de potenciais genes alvo em resposta ao estresse salino em soja (Glycine max)

Abstract

Estresses por seca e salinidade são algumas das causas primárias de perdas na agricultura. O estresse salino reduz o crescimento das plantas e o rendimento de produção, devido a danos causados pelo potencial osmótico e toxicidade iônica, e atinge 6% das terras cultivadas mundialmente. A soja é uma das culturas amplamente prejudicada por este estresse, portanto o estudo dos processos regulatórios de expressão gênica em ambientes salinos é muito importante para aumentar o conhecimento e identificar possíveis alvos para o melhoramento genético. MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores, de aproximadamente 22 nucleotídeos, que modulam a expressão gênica por silenciamento através de inibição sequência-específica do RNA mensageiro alvo. O presente trabalho visa analisar a expressão gênica diferencial de microRNAs maduros e de seus potenciais genes alvos em resposta ao estresse salino em soja. Para tal objetivo, foram obtidas bibliotecas de RNA-seq de RNAs mensageiros e de pequenos RNAs de plântulas de soja trifolioladas incubadas com 200 mM de NaCl por 4h. Primeiramente, foi realizada uma análise do padrão de expressão dos microRNAs de soja utilizando o script isomirID e o pacote DESeq2 no ambiente R. Foram obtidos 87 microRNAs com padrão de expressão diferencial utilizando um nível de significância de 10-5. As bibliotecas de sequenciamento de RNA mensageiros foram analisadas com auxílios dos softwares TopHat2 e HTSeq-count. Com o uso do pacote DESeq2 foram identificados 3726 genes diferencialmente expressos (fold change maior que 2 e nível de significância de 0,01). Foram preditos genes alvos para os 87 microRNAs diferencialmente expressos utilizando a ferramenta psRNATarget. Com este resultado, foi organizada uma tabela contendo os microRNAs e seus genes alvos preditos, ou seja, aqueles que apresentaram padrão de expressão inverso. Três microRNAs (mir172k, mir5371 e mir1512abc) e seus respectivos alvos com funções de trealose-6-fosfate sintase, endoribonuclease L-PSP e U-box E3 ligase) foram selecionados. Os dados de expressão dos genes alvos potenciais foram confirmados por RT-qPCR. Este trabalho identificou microRNAs e seus respectivos genes alvo responsivos ao estresse salino, que podem possuir papel fundamental na tolerância a este estresse.

Salinity and drought are primary causes of agricultural losses. Salt stress reduces plant growth and production yield due to osmotic stress and ion toxicity and affects 6% of the world’s agricultural land. Soybean is widely damaged by this stress. So far, it is important to understand how gene expression is regulated in order to identify targets for plant breeding. MicroRNAs are small non-coding RNAs (~22 nt) that modulate plant gene expression through sequence-specific inhibition of target mRNAs. The aim of this study is to analyze differential gene expression of mature microRNAs and their target genes during salt stress in soybean. We performed deep sequencing of mRNAs and small RNAs of salt-stressed soybean seedlings incubated in 200mM of NaCl for 4h. First, we analyzed the expression pattern of microRNAs with isomirID and DESeq2. We identified 87 differentially expressed microRNAs with significance level 10-5. DESeq2 and we obtained 3726 differentially expressed genes with significance level 0,01. After, we predicted targets to the 87 differentially expressed microRNAs using psRNATarget and we organized a table with all microRNAs and their putative targets with reverse expression pattern. Three microRNAs(mir172k, mir5371 and mir1512abc) and their putative targets (threalose-6-phosphate synthase, endoribonuclease L-PSP and U-box E3 ligase) were selected. The expression pattern of the putative targets were analyzed by RT-qPCR and we noticed that threalose-6-phosphate synthase and U-box E3 ligase are responsive after 1h treatment with 200mM of NaCl. This work identified microRNAs and their target genes responsive to salinity, which can be important to the tolerance of salt stress.