Avaliação de parâmetros nociceptivo e de estresse oxidativo em medula espinal de ratos com dor neuropática induzida por constrição crônica gradual no nervo isquiático

Abstract

A dor neuropática (dor devido a uma lesão ou doença que afeta o sistema somatossensorial) afeta 6-10% da população mundial e reduz significativamente a qualidade de vida das pessoas acometidas por ela. Apesar de muitos avanços, ainda se desconhece os mecanismos envolvidos na codificação e transmissão da dor neuropática. Os estudos que buscam compreender esses mecanismos utilizam, em sua maioria, modelos animais. Um estudo prévio criou o modelo intitulado dor neuropática graduada, no qual quatro amarrações são realizadas em torno do nervo isquiático de ratos. Porém, a amarração é gradativa e realizada em animais diferentes, e os fios não amarrados são deixados no espaço subcutâneo. Esse modelo mimetiza a variação dolorosa observada nos pacientes com dor neuropática. No modelo, o número de amarrações se relacionou com a diminuição no limiar mecânico e com a ativação de células gliais na medula espinal de ratos. Os estudos mostram que células gliais ativadas liberam espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais desempenham papel importante na dor crônica. Contudo, é desconhecido se a formação de ROS se relaciona com o número de amarrações no modelo de dor neuropática graduada. Assim, este estudo avaliou a formação de ânion superóxido (SAG), uma ROS, os tióis totais, um antioxidante, e a capacidade antioxidante total (TAC) na medula espinal lombossacral de ratos com dor neuropática induzida por constrição gradual no nervo isquiático. Foram também avaliadas as sensibilidades mecânica e térmica e o índice funcional do nervo isquiático (SFI), a primeira para validação do modelo e as demais por serem testes comumente utilizados para avaliação da condição dolorosa em ratos. Após aprovação ética (#27548), ratos Wistar machos, pesando entre 200-300g, foram divididos em 6 grupos experimentais (n=6/grupo): Controle (animais não submetidos à manipulação cirúrgica); Sham (animais que sofreram incisão dos tecidos até a visualização do nervo isquiático); N0S4 (ratos sem amarradura no nervo isquiático, mas com 4 segmentos de fio de sutura no espaço subcutâneo da pata direita); N1S3 (ratos com 1 amarradura no nervo isquiático e 3 segmentos de fio de sutura no espaço subcutâneo da pata direita); N2S2 (ratos com 2 amarraduras no nervo isquiático e 2 segmentos de fio de sutura no espaço subcutâneo da pata direita); N4S0 (ratos com 4 amarraduras no nervo isquiático e nenhum segmento de fio de sutura no espaço subcutâneo da pata direita). Esses ratos foram submetidos aos testes de von Frey eletrônico, da placa quente e da marcação das patas antes da cirurgia (pré-lesão) e aos 3, 5, 7 e 10 dias após o procedimento cirúrgico para avaliação das sensibilidades mecânica e térmica e do SFI, respectivamente. Aos 3 e 10 dias, os ratos foram mortos por decapitação para obtenção do segmento lombossacral da medula espinal, usado para a determinação de SAG, tióis totais e TAC. Os parâmetros nociceptivos foram analisados por ANOVA de medidas repetidas, e os oxidativos por ANOVA de duas vias (fatores: lesão e tempo), seguidos do pós-teste de Tukey (P<0,05). A correlação de Pearson foi calculada entre os valores de von Frey e a SAG e tióis totais, no período 3 dias. A redução no limiar mecânico se relacionou com o número de amarrações, o que não ocorreu no limiar térmico e no SFI. Nesses, uma possível relação se deu apenas entre os percentuais de diminuição. A SAG aumentou e os valores de tióis totais diminuíram, e as mudanças correlacionaram-se com o número de amarrações. A TAC não foi alterada nesse modelo. Assim, os resultados mostram a reprodução do modelo. O limiar térmico e o SFI parecem relacionar-se com o número de amarrações. Por sua vez, a SAG e os tióis totais também se relacionam com esse número.

Neuropathic pain (pain due to an injury or disease affecting the somatosensory system) affects 6-10% of the world population and significantly reduces the quality of life of people affected by it. Despite many advances, the mechanisms involved in neuropathic pain are still unknown. Most of the studies designed to understand these mechanisms use animal models. A previous study created a model named graded neuropathic pain, in which four chromic gut sutures are placed around the sciatic nerve of rats. However, sutures are graded and performed on different animals, and untied sutures are left in the subcutaneous space. This model mimics the pain variation observed in patients with neuropathic pain. In this model, the number of sutures was related to a decrease in mechanical threshold and activation of glial cells in spinal cord. A number of studies have shown that activated glial cells release reactive oxygen species (ROS), which plays an important role in chronic pain. However, it is unknown if ROS formation is related to the number of sutures in graded neuropathic pain model. Thus, this study evaluated superoxide anion generation (SAG), a ROS, total thiols, an antioxidant, and total antioxidant capacity (TAC) in lumbosacral spinal cord of rats with neuropathic pain induced by gradual constriction of the sciatic nerve. Mechanical and thermal thresholds and the sciatic functional index (SFI) were also evaluated, the former to confirm the reproducibility of the model and the others because they are tests commonly used to evaluate painful conditions in rats. After ethical approval (#27548), male Wistar rats weighing 200-300g were divided into 6 experimental groups (n= 6/group): Control (rats which did not undergo surgical manipulation); Sham (animals which were submitted to tissues incision); N0S4 (rats with no suture around the sciatic nerve and 4 chromic gut placed subcutaneously in right paw); N1S3 (rats which had 1 chromic gut suture around the sciatic nerve and 3 chromic gut placed subcutaneously in right paw); N2S2 (rats which had 2 chromic gut suture around the sciatic nerve and 2 chromic gut placed subcutaneously in right paw); N4S0 (rats which had 4 chromic gut suture around the sciatic nerve and no chromic gut placed subcutaneously). Rats were submitted to the electronic von Frey, hot plate and paw marking tests just before the surgery (pre-injury) and at 3, 5, 7 and 10 days after the surgical procedure to evaluate the mechanical and thermal thresholds and SFI, respectively. At days 3 and 10, rats were decapitated and lumbosacral spinal cord used for determination of SAG, total thiols and TAC. Nociceptive parameters were analyzed by repeated-measures ANOVA and oxidative parameters by two-way ANOVA (factors: injury and time), followed by Tukey's post-test (P<0.05). Pearson’s correlation was calculated between von Frey, SAG and total thiols at day 3. Mechanical was threshold reduced and related to the number of sutures, which did not occur for thermal threshold and SFI. In these, a possible relation occurred only in percentages of decrease. SAG increased and total thiols decreased, and the changes were correlated with the number of sutures. TAC did not change in this model. Thus, there was a replication of the model. Thermal threshold and SFI seem to be related to number of sutures. In turn, SAG and total thiols are also related to this number.