Análise estrutural de mutações no gene F8 em pacientes com hemofilia A

Abstract

A hemofilia A (HA) é um distúrbio hemorrágico causado pela deficiência do fator VIII da coagulação (FVIII), resultante de alterações no gene F8 que codifica essa proteína. Vários tipos de mutações já foram descritas no gene F8 como causadoras de HA. Devido à grande heterogeneidade clínica da doença e à variedade de mutações encontradas, estudos para o melhor entendimento acerca da estrutura e função do FVIII se tornam essenciais. Este trabalho tem como objetivo analisar e correlacionar diferenças estruturais e funcionais em mutações de sentido trocado previamente identificadas em pacientes com hemofilia A no Rio Grande do Sul, estabelecendo a relação genótipo-fenótipo para cada caso. Foram analisadas 12 mutações de sentido trocado localizadas na cadeia leve do FVIII, identificadas em estudos anteriores. Com o intuito de avaliar a patogenicidade das substituições, foram verificados bancos mundiais de variantes (1000 genome browser e UCSC genome browser) e realizadas predições de dano em cinco algoritmos: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2), Mutation Taster, PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), SIFT (Sorting Intolerant to Tolerant) e HOPE (Have yOur Protein Explained). Modelos estruturais para a sequência selvagem e para cada uma das mutações estudadas foram gerados no programa Phyre-2 (Expert Mode–one to one Threading), através de modelagem por homologia baseada na estrutura 4BDV obtida no PDB (Protein Data Bank). O potencial eletrostático (PE) foi calculado para cada uma das estruturas com a ferramenta DelPhi Web Server. O programa webPIPSA (Protein Interaction Property Similarity Analysis) foi utilizado para realizar a clusterização das estruturas a partir de suas similaridades eletrostáticas. As informações obtidas do PIPSA foram comparadas com os dados de potencial eletrostático gerados para cada mutação na ferramenta Delphi, através de uma análise visual com a implementação da interface Chimera. Neste estudo, foi possível identificar alterações eletrostáticas na superfície de nove das doze mutações (75%) de sentido trocado analisadas. A substituição de aminoácidos nessas estruturas ocasionou um afastamento dos modelos estruturais gerados da proteína selvagem, enquanto que as estruturas onde não houve alterações no potencial eletrostático (25%) foram agrupadas com a estrutura selvagem. Verificamos também que muitos modelos apresentaram alterações nas ligações de hidrogênio e/ou modificações em sua hidrofobicidade. Além disso, a troca de aminoácidos resultou na perda de uma ponte dissulfeto em uma das mutações do estudo. As diferenças estruturais observadas a partir das substituições de aminoácidos modificam propriedades importantes para a função do FVIII, podendo contribuir para o fenótipo encontrado nos pacientes com hemofilia A.

emophilia A (HA) is a bleeding disorder caused by factor VIII (FVIII) deficiency due to mutations in F8 gene, which encodes this protein. Several types of mutations have already been described in the F8 gene causing HA. Considering the clinical heterogeneity of HA and the diversity of mutations found in F8, a better understanding of protein structure and function become essential. The present study has the intent to analyze and correlate structural changes in missense mutations previously reported on HA patients of Rio Grande do Sul population and make genotype-phenotype correlations for each case reported. A total of 12 missense mutations in the light chain of FVIII were included in this study. The pathogenicity of the substitutions were verified using databanks (1000 genome browser and UCSC genome browser) and five distinct algorithms: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2), Mutation Taster, PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), SIFT (Sorting Intolerant to Tolerant) and HOPE (Have yOur Protein Explained).Structural models were generated for wild and mutated sequences by homology approaches based on the PDB structure 4BDV using Phyre-2 (Expert Mode–one to one Threading) tool. The electrostatic potential (EP) were calculated for each structure using the Delphi web server. Structures were clusterized based on electrostatic similarities using the software webPIPSA (Protein Interaction Property Similarity Analysis).The information obtained on PIPSA was compared with the electrostatic pattern generated on Delphi webserver implemented on Chimera interface, by visual inspection. In this study were identified electrostatic changes on the surface of 9/12 missense mutations (75%) analyzed. These amino acids substitutions leads to a distancing from wild type, while structures with no electrostatic changes (25%) were grouped with wild structure. The structures presented hydrogen-bonds and hydrophobicity alterations, too. Furthermore one of the substitutions results in disulphide-bond disruption. The structural modifications observed alter important properties for the FVIII function, possibly contributing to the phenotype of hemophilia A patients.