Análise da expressão do gene MK2 ao longo do processo de estabilização de Mesocestoides corti

Abstract

Proteíno-quinases ativadas por mitógenos (MAPKs, de mitogen-activated protein kinases) são serino/treonino-proteíno-quinases que realizam a conversão de estímulos extracelulares em uma variedade de respostas celulares. MAPKs estão entre os componentes de algumas das principais e mais conservadas rotas de transdução de sinais que regulam muitos processos fisiológicos, incluindo a progressão do ciclo celular, a migração celular, a organização do citoesqueleto e o remodelamento da cromatina. Estudos moleculares envolvendo platelmintos da classe Cestoda têm demonstrado que as MAPKs possuem um papel fundamental no desenvolvimento destes organismos. Análises transcritômicas preliminares realizadas pelo nosso grupo, evidenciaram a expressão diferencial do gene que codifica uma proteína da família das MAPKs chamada MAPK-proteíno-quinase ativada (MK2) entre os estágios larval e adulto do cestódeo Mesocestoides corti, sugerindo seu possível envolvimento na regulação do desenvolvimento deste parasito. M. corti é uma espécie-modelo para o estudo da classe Cestoda, utilizado inclusive para a investigação do processo de diferenciação da larva (tetratirídeo) no verme adulto, chamado de estrobilização. Platelmintos cestódeos são agentes etiológicos de parasitoses importantes (cestodíases), tanto em seres humanos como em animais, causando doenças como a hidatidose e a cisticercose. Assim, o estudo de aspectos básicos da biologia destes parasitos é importante para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e controle de cestodíases. O objetivo geral deste trabalho é a investigação do possível envolvimento da MK2 de M. corti em uma rota de sinalização de MAPKs, que pode regular o processo de estrobilização deste parasito. A sequência codificadora da McMK2 foi amplificada por PCR e clonada por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão em pGEX-4T1-TEV. O plasmídeo recombinante construído foi então utilizado para a transformação genética de células de Escherichia coli BL21- CodonPlus-RP. As condições de expressão da McMK2 recombinante (rMcMK2) foram otimizadas e a proteína recombinante foi purificada para utilização na imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais monoespecíficos. Tais anticorpos serão posteriormente utilizados em experimentos de imunolocalização, para avaliação dos padrões de expressão espaciais e temporais da McMK2 em diferentes estágios do desenvolvimento estrobilar de M. corti. Os níveis de expressão do gene McMK2, codificador da McMK2, foram investigados por meio de RT-qPCR. Uma diminuição significativa na expressão do gene McMK2 foi observada no verme estrobilado, em comparação com a expressão em tetratirídeos, sugerindo que esta proteína pode estar envolvida com a regulação da estrobilização de M. corti.

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are serine/threonine-protein kinases that convert extracellular stimuli into a variety of cellular responses, participating of some of the major and most conserved signal transduction pathways and regulating many physiological processes. Molecular studies involving parasite platyhelminthes of the Cestoda class (cestodes), have reported the importance of MAPKs on the development of these parasites. Previous transcriptomics studies carried out with Mesocestoides corti, a cestode parasite, to search for differentially expressed genes between larvae (tetrathyridia) and adult (proglottized and segmented) worms allowed to identify a M. corti gene that codes for a possible ortholog of a vertebrate MAPK-activated protein kinase 2 (MK2), also a component of MAPK signal pathways. M. corti, is an useful experimental model to investigate the cestode developmental processes, such as those involved in the transition of the larval to the adult worm stage, which is called strobilation. Cestodes are etiological agents of important helminthiases, such as hydatidosis and cysticercosis, which affect both humans and animals. The study of basic aspects of cestode biology is important for the development of new strategies for prevention and control of helminthiases. The aim of this work is to investigate the possible involvement of M. corti MK2 (McMK2) in MAPK signal transduction pathways that might regulate the strobilation process of this parasite. The McMK2 coding sequence was amplified by RT-PCR and cloned into the pGEX-4T1-TEV plasmid by in vivo homologous recombination in Escherichia coli KC8 cells. E. coli KC8 transformed cells were analyzed by PCR in order to identify colonies carrying the recombinant construction (pGEX-McMK2). E. coli strain BL21-CodonPlus-RP were transformed with pGEXMcMK2 plasmid used for the expression of the recombinant McMK2 protein (rMcMK2). Different induction conditions with different concentrations of isopropyl-β-D1thiogalactopyranoside (IPTG), incubation times and temperatures were evaluated in order to optimize rMcMK2 heterologous expression, which was evaluated by SDSPAGE. The rMcMK2 was expressed and purified, free of the GST moiety, by affinity chromatography coupled with TEV digestion. Rabbits will be immunized with the purified rMcMK2 in order to produce monospecific polyclonal antibodies against McMK2. The anti-McMK2 antibodies produced will be used in immunolocalization experiments, to assess the spatial and temporal expression patterns of McMK2 along M. corti strobilar development. The transcriptional levels of McMK2 encoding gene (McMK2) were investigated by qPCR. A significant decrease of the expression levels of the McMK2 gene was observed on strobilated stage, compared with tetrathyridia. This results suggests a possible involvement of this protein at regulation of the M. corti strobilation process.