Avaliação in vitro do comportamento de células-tronco mesenquimais em scaffolds contendo diferentes concentrações de alginato e cloreto de cálcio como estratégia em medicina regenerativa

Abstract

O alginato é um biomaterial amplamente utilizado nas áreas de odontologia, farmácia e indústria de alimentos, e vem sendo estudado também devido às suas potenciais aplicações em medicina regenerativa. Trata-se de um polímero natural obtido de diversas espécies de algas. Sob condições ideais de pH, com a adição de um íon bivalente, como o cálcio, é capaz de formar um hidrogel (processo chamado de crosslinking) que possui propriedades semelhantes à matriz extracelular, sendo um candidato à engenharia de tecidos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar quais as concentrações ideais de cálcio, alginato e células-tronco mesenquimais (CTM) para a produção de scaffolds como estratégia em medicina regenerativa. Primeiramente as células foram tratadas unicamente com cálcio para analisar-se o efeito tóxico do íon em excesso. Posteriormente, as células, em uma densidade de 400.000/poço, foram misturadas ao alginato 1% (m/v) e tratadas com diferentes concentrações de cloreto de cálcio (0; 25; 50; 75; e 100mM) para o crosslinking. Como controle, as células foram cultivadas normalmente em placa de cultura. Em um experimento subsequente, 400.000 células/poço foram misturadas a alginato 0,5% e 1%, com a adição de 50mM de cloreto de cálcio. Por fim, as CTM, em concentrações de 100.000, 200.000 e 400.000 por poço foram adicionadas ao alginato 1% e tratadas com 50 mM de cloreto de cálcio. Os experimentos foram realizados com CTMs extraídas de dentes esfoliados decíduos humanos e a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT e visualizada por microscopia de fluorescência após coloração com diacetato de fluoresceína e iodeto de propídio. Como medida de citotoxicidade, a enzima lactato desidrogenase (LDH) foi dosada e o cálcio foi quantificado. Resultados mostraram que após poucas horas, mesmo pequenas quantidades de cálcio já foram tóxicas para as células na ausência do alginato. Ainda, foi demonstrado que, após uma semana, não foi observada diferença estatística significativa entre os scaffolds de 1% alginato, reticulado com 50mM de cálcio, com 100.000 células e os poços controle. No entanto, em concentrações maiores (principalmente de 400.000/poço), foi observado que a viabilidade celular foi superior nos scaffolds. Ainda, as concentrações de cálcio livre se mantiveram constantes, e as dosagens de LDH corroboraram com os dados acima. Após sete dias, as absorvâncias médias de 400.000 células nos scaffolds de 1% de alginato com 25 e 50mM foram superiores ao controle; porém, experimentos 7 demonstraram que 25mM do íon não foram capazes de reticular completamente o alginato, gerando géis muito fluidos. Da mesma forma, os hidrogéis de alginato 1% tiveram melhor desempenho em relação ao controle, uma vez que os de 0,5% geraram scaffolds muito maleáveis, levando à perda de células durante sua manipulação. Esses resultados sugerem que o alginato fornece um microambiente tridimensional que parece favorecer a sobrevivência celular, enquanto que a mesma quantidade de células cultivadas na placa não possui as mesmas condições. Ainda, alginato 1% e 50mM de cloreto de cálcio demonstraram os melhores resultados ao mimetizar, tanto quanto possível, as características de uma matriz extracelular natural.

Alginate is a biomaterial widely used in the areas of odontology, pharmacy and food industry, and has been studied also due to its potential applications in regenerative medicine. It is a naturally occurring polymer obtained from different species of brown algae. In a certain pH range, with the addition of a bivalent ion such as calcium, it is capable of forming a hydrogel with properties similar to the extracellular matrix, becoming a potential tool in tissue engineering. The aim of this study was to evaluate which concentrations of calcium, alginate and mesenchymal stem cells (MSC) are ideal to the construction of scaffolds as a strategy in regenerative medicine. First, stem cells were treated only with calcium chloride, in order to analyse the toxicity of the excess of the ion to MSC. Thereafter, MSC, in a density of 400.000/well, were mixed to alginate 1% (w/v) and treated with different concentrations of calcium chloride (0; 25; 50; 75 and 100mM) to reticulate the biomaterial. As control, cells were cultivated as usual in the tissue culture plate. In another experiment, 400.000 cells/well were mixed to 0.5% and 1% alginate, and 50mM of calcium chloride were added. Ultimately, MSC, in the 100.000, 200.000 and 400.000 per well were added to 1% alginate and treated with 50mM of calcium chloride. Experiments were performed with MSC obtained from human exfoliated deciduous teeth and cell viability was assessed via MTT assay and visualized with fluorescence microscopy after fluorescein diacetate and propidium iodide staining. As a measure of cytotoxicity, the lactate dehydrogenase enzyme was dosed and free calcium was quantified. Results showed that after a few hours, even the smallest excess of calcium was toxic to the cells in the absence of alginate. Moreover, it was demonstrated that, after seven days, no significant statistical difference between scaffolds with 1% alginate, crosslinked with 50mM of calcium and 100.000 cells and the control wells (with the same concentration of MSC). However, in higher concentrations (especially 400.000/well) it was observed that cell viability was superior in the scaffolds. Furthermore, free calcium concentrations remained constant and LDH dosages corroborated with the data above. After seven days, the average absorbances of 400.000 cells in 1% alginate scaffolds with 25 and 50mM of calcium were superior to control; however, experiments have demonstrated that 25mM were not sufficient for completely reticulating alginate, giving rise to soft gels. In the same way, 1% alginate scaffolds showed better results in terms of viability when compared to control, and 9 0.5% alginate generated very malleable scaffolds, leading to the loss of a number of cells during manipulations. These results suggest that alginate provides a three-dimensional microenvironment which seems to favour survival of big quantities of cells, while the same amount of cells cultivated in the tissue culture plate may not have the same conditions. Besides that, 1% alginate and 50mM calcium chloride demonstrated the best results in mimicking, as far as possible, the characteristics of a natural extracellular matrix.