Efeitos do co-tratamento de ácido retinoico e cisplatina sobre processos envolvendo senescência celular em células da linhagem A549

Abstract

As terapias tradicionais no combate ao câncer baseiam-se em estratégias de tratamento citotóxicas onde a completa destruição celular otimiza o potencial de sobrevivência dos pacientes. Porém, muitas abordagens são limitadas devido aos efeitos colaterais, que incluem o desenvolvimento de resistência ao tratamento e recorrência tumoral. Buscando-se otimizar as respostas aos tratamentos surgem novas combinações de fármacos, como é o caso da combinação de cisplatina e ácido retinoico em câncer de pulmão. Apesar disso, a cisplatina é uma droga indutora de senescência celular em diferentes linhagens. Células senescentes permanecem viáveis e metabolicamente ativas, paradas no ciclo celular, e em contraste às células sujeitas a apoptose em resposta a drogas citotóxicas, células senescentes podem persistir no microambiente tumoral. Desta forma torna-se necessário um melhor entendimento dos efeitos dessas combinações e a relação destas com os processos celulares de adaptação ao estresse. O objetivo principal do trabalho foi avaliar os efeitos da combinação de cisplatina e ácido retinoico no tratamento de uma linhagem de adenocarcinoma pulmonar chamada A549, investigando o papel da senescência celular e sua relação com processos celulares como apoptose e autofagia. O tratamento foi desenhado da seguinte forma: pré-incubação com ácido retinoico durante 24 horas, seguido de co-tratamento com cisplatina e ácido retinoico em períodos de 24, 48 e 72 horas. As doses de cisplatina dos grupos variaram de 0, 1 e 5 µg/mL, enquanto que a dose de ácido retinoico foi de 20 µM. As células positivas para senescência celular foram identificadas por microscopia ótica através do ensaio da β-galactosidase associada à senescência, mostrando que grupos contendo somente cisplatina induzem a senescência celular de maneira dose e tempo dependente, enquanto que grupos contendo ácido retinoico demonstraram uma evasão da indução do processo senescente. O ensaio de ciclo celular revelou que os grupos tratados somente com cisplatina tiveram uma desregulação do ciclo celular, quando comparados aos grupos tratados com cisplatina e ácido retinoico, causando uma mudança nos estados de G1 para estados S/G2 do ciclo celular. O ensaio de anexina V-FITC revelou que os grupos tratados com ácido retinoico tiveram a viabilidade celular aumentada quando comparadas com grupos com apenas cisplatina. O ensaio de laranja de acridina apontou que os grupos tratados com ácido retinoico tiveram maior taxa de células marcadas para autofagia quando comparadas tanto ao controle quanto a grupos tratados somente com cisplatina. Já os ensaios de MitoStatus TMRE mostraram que os grupos contendo ácido retinoico tiveram o potencial de membrana aumentado quando comparado aos outros grupos, inferindo que a viabilidade celular geral é diretamente relacionada à viabilidade ou saúde mitocondrial. Esses resultados sugerem que a cisplatina combinada ao ácido retinoico no tratamento contra câncer de pulmão na clínica deve ser reinvestigado e reconsiderado, tendo em vista que o escape do processo de senescência celular é um mecanismo conhecido de desenvolvimento de tumor em diversas células imortalizadas humanas. Além disso, grupos contendo ácido retinoico demonstraram uma morfologia e fisiologia mais saudável em relação aos grupos que continham cisplatina, significando que o ácido retinoico pode impactar na genotoxicidade da cisplatina. Em uma situação onde a cisplatina tem um papel na senescência induzida por terapia, seria sensato adotar o uso de agentes senolíticos como uma segunda linha de tratamento para minimizar a possível recuperação de subpopulações e evitar a recorrência da doença.

Traditional cancer therapies rely on cytotoxic treatment strategies where the complete cellular destruction of tumour optimizes the potential for patient survival. However, many approaches are limited due to side effects, including development of resistance to treatment and cancer recurrence. In attempt to optimize treatment response, new drugs combinations emerged, such as the combination of cisplatin and retinoic acid in lung cancer. However, cisplatin seems to induce cellular senescence in different cell lines. Senescent cells remain viable and metabolically active, while cell-cycle arrested; and in contrast to cells subjected to apoptosis in response to cytotoxic drugs, senescent cells can persist in the tumour microenvironment. Thus, a better understanding of the effects of these combinations and their relationship with cellular processes of stress adaptation becomes necessary. The main objective of this work was to evaluate the effects of the combination of cisplatin and retinoic acid treatment in A549 human lung carcinoma cell line, inspecting the role of senescence and the relation between cellular processes such as apoptosis and autophagy. The treatment was designed thusly: pre-incubation with retinoic acid during 24 hours, followed by co-treatment with cisplatin and retinoic acid in periods of 24, 48 and 72 hours. Cisplatin doses in groups were 0, 1 and 5 µg/mL, along with retinoic acid in 20 µM. Positive senescent cells were identified through the SA--Gal assay by optical microscopy, showing us that cisplatin only groups induces cell senescence in a dose and time-dependent manner, meanwhile groups containing retinoic acid leads to evasion from the senescence induction by cisplatin. The cell cycle assay revealed that cisplatin-only treated groups showed a cell cycle deregulation compared to retinoic acid + cisplatin groups causing a shift from G1 state to a S/G2 cell cycle state. The annexin V-FITC assay unveiled that groups treated with retinoic acid had their cellular viability raised when compared to cisplatin-only groups. Acridine orange staining assay uncovered that retinoic acid groups augmented autophagy cell state compared both to controls and to cisplatin-only groups. MitoStatus TMRE assay showed us that groups containing retinoic acid had their mitochondria membrane potential state augmented when compared to cisplatin-only groups, inferring that the overall cell viability is related to overall mitochondrial health. Results have suggested that retinoic acid combined to cisplatin use in treatment against lung adenocarcinoma in clinic should be re-investigated and reconsidered as escape from senescence is a well-known mechanism of tumour development in many immortalized human cells. Besides that, retinoic acid groups showed a healthier morphology and physiology when compared to cisplatin groups, meaning that retinoic acid might impact cisplatin genotoxicity. In a situation where cisplatin plays role in a therapy-induced senescence, it would be wise to adopt the use of so called senolytic agents as a second line treatment to minimize subpopulation recovery and avoid disease recurrence.