Estudo in vitro das oscilações da formação hipocampal e o envolvimento do sistema gabaérgico em epilepsia

Abstract

As epilepsias afetam aproximadamente 65 milhões de pessoas mundialmente, e representam um grupo de doenças com etiologias, padrões de eletroencefalograma (EEG) e comorbidades heterogêneas. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia focal em adultos, refratária aos tratamentos disponíveis. As características estruturais da ELT envolvem alterações morfofuncionais do hipocampo, como a esclerose hipocampal, reorganização sináptica dos microcircuitos neuronais, prejuízo no funcionamento do sistema GABAérgico, na conectividade neuronal e mudanças nos padrões oscilatórios. A caracterização de padrões oscilatórios, por meio de registros de potencial de campo local in vitro, pode contribuir para descobertas que são significativamente úteis para o entendimento da rede hipocampal anormal durante a epileptogênese. A avaliação destes padrões pode ser útil para identificar biomarcadores de processos neuropatológicos em andamento em doenças do sistema nervoso central (SNC), como a epilepsia, e particularmente a ELT com comprometimento da formação hipocampal, que possui uma organização peculiar da rede neuronal. Neste trabalho, caracterizamos a atividade oscilatória in vitro e sua sincronia na formação hipocampal de ratos Wistar epilépticos adultos, em dois estágios da epileptogênese, 30 e 60 dias após o Status Epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina. Registros extracelulares foram realizados em pares nas regiões córtex entorrinal (CE)-giro dentado (GD), GD-CA3, CA3-CA1 e CE-CA1 de fatias contendo a formação hipocampal de animais epilépticos (n=19) e de animais controle pareados por idade (n=20). Os registros foram realizados durante hiperexcitabilidade induzida por 4-aminopiridina (4-AP) no líquido de perfusão e durante a atividade espontânea da rede, sem 4-AP. Inicialmente, avaliamos a geração de eventos ictais e interictais induzidos por 4-AP em fatias de animais epilépticos e controle pareados por idade. Em seguida, foram selecionados trechos de 5s no intervalo de eventos epileptiformes interictais nos intervalos dos eventos interictais, e trechos de 5s de atividade espontânea da rede (sem atividade epileptiforme), afim de quantificar a densidade espectral de potência (PSD) (nepoch = 30-50) e coerência de fase (nepoch= 20-25) das oscilações registradas. Foi possível demonstrar que aos 30 dias após SE, a região CA1 das fatias de animais epilépticos, perfundidas com 4-AP, obtiveram maior ictogênese e maior potência das oscilações gama em CE, CA1 e CA3 e das oscilações de alta frequência (HFOs) em CA3. A coerência de fase foi maior em gama médio entre CA1-CA3 e CE-CA1 e em HFOs entre CE-CA1 neste período nos animais epilépticos. Aos 60 dias após SE, observamos um aumento da ictogênese em CE e GD; maior potência das oscilações gama em CA1, CA3 e GD, e de HFOs em CE, CA3 e GD; e maior coerência de fase em HFOs entre CA1-CA3. Durante a atividade espontânea da rede, sem 4-AP, aos 30 dias após SE, as fatias de animais epilépticos também apresentaram maior potência das oscilações gama em todas as regiões registradas, e de HFOs no CE. Aos 60 dias após SE, as regiões do CE, CA3 e DG de fatias de animais epilépticos apresentaram maior potência das oscilações gama, maior potência de HFOs no GD; e maior coerência de fase em fast ripples entre GD-CA3, quando comparado ao grupo controle. Os resultados acima mostram alterações específicas nos padrões oscilatórios de acordo com o período da epileptogênese e de acordo com a região da formação hipocampal. Além disso, esses resultados ressaltam o papel crucial das oscilações gama e HFOs em processos patológicos em andamento durante reorganização da rede neuronal, cruciais para o estabelecimento da epilepsia e também para a manutenção recorrente da hiperexcitabilidade da rede. A alteração dos padrões oscilatórios e da sincronia da rede hipocampal podem refletir 6 o funcionamento dinâmico do sistema GABAérgico inibitório durante o desenvolvimento da ELT. De fato, os interneurônios GABAérgicos coordenam dinamicamente a atividade das redes hipocampais, sendo de fundamental importância para a geração da atividade oscilatória, contribuindo para epileptogênese e ictogênese, demonstrando sua função no controle e na geração das crises epilépticas que vai além da inibição convencional.

The epilepsies affect approximately 65 million people worldwide, and represent a group of diseases with heterogeneous etiologies, electroencephalogram (EEG) patterns, and comorbidities. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of drug-refractory focal epilepsy in adults. The structural features of TLE involve morphofunctional changes in the hippocampus, such as hippocampal sclerosis, synaptic reorganization of neuronal microcircuits, impairment of the GABAergic system, neuronal connectivity and changes in oscillatory patterns. The characterization of oscillatory patterns, through in vitro local field potential recordings, may contribute to findings that are significantly useful for understanding the abnormal hippocampal network during epileptogenesis. The evaluation of these patterns can be useful to identify biomarkers of ongoing neuropathological processes in central nervous system (CNS) diseases, such as epilepsy, and particularly TLE with impairment of the hippocampal formation, which has a peculiar neuronal network organization. Here, we characterized the in vitro oscillatory activity and its synchrony within the hippocampal formation of adult epileptic male Wistar rats at two different stages of epileptogenesis, 30 and 60 days after pilocarpine-induced Status Epilepticus (SE). Extracellular pair recordings were performed in Entorhinal cortex (EC)- Dentate gyrus (DG), DG-CA3, CA3-CA1 and EC-CA1 of hippocampal formation slices of epileptic (n=19) and aged-matched control (n=20) animals under 4-Aminopyridine (4-AP)-induced hyperexcitability or under spontaneous network activity condition, without 4-AP. First, we evaluated the 4-AP-induced ictal and interictal events in hippocampal-EC slices from epileptic and control age-matched rats. Thereafter, we selected 5s-epochs intervals between interictal epileptiform events (IEDs) and 5s-epoch of spontaneous network activity, without 4-AP, to perform the power spectral density (PSD) (nepoch= 30-50) and phase coherence (nepoch= 20-25) analysis. We found that at 30 days post-SE, 4-AP bathed slices from epileptic animals had increased ictogenesis in CA1; higher power of gamma bands in EC, CA1 and CA3; and high-frequency oscillations (HFOs) in CA3. Phase coherence was higher in middle gamma between CA1-CA3 and EC-CA1, and in HFOs between EC-CA1. At 60 days post-SE, we observed increased ictogenesis in EC and DG; higher power of gamma bands in CA1, CA3 and DG, HFOs in EC, CA3 and DG; and higher phase coherence in HFOs between CA1-CA3. Under spontaneous network activity at 30 days post-SE, slices from epileptic animals already presented higher power of gamma bands in all recorded regions, and HFOs in EC. At 60 days post-SE, they had higher power of gamma bands in EC, CA3 and DG, higher power of HFOs in DG; and higher phase coherence in fast ripples oscillations between DG-CA3, when compared to controls. We found, in a region- and stage-specific manner, alterations in gamma and HFOs within the hippocampal formation of epileptic animals under a second insult of hyperexcitability and during the spontaneous network activity, without epileptiform activity. Our results suggest the critical role of gamma and HFOs in ongoing pathological processes of network reorganization, crucial to the epilepsy establishment and recurrent feedback of hyperexcitability. The altered oscillatory patterns and network interactions in the hippocampal formation may reflect the functional involvement of inhibitory mechanisms during the development of TLE. In fact, GABAergic interneurons dynamically coordinate the activity of hippocampal networks, being of critical importance for the generation of oscillatory activity, and consequent contributing to epileptogenesis and ictogenesis, demonstrating an unconventional function beyond the control of seizures.