Avaliação in vitro do potencial terapêutico do extrato de Fasciola hepatica em fibroblastos sinoviais de camundongos com artrite induzida por colágeno

Abstract

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune, crônica e sistêmica, onde a inflamação da membrana sinovial articular leva à degradação da cartilagem e do osso, resultando na destruição articular, dor e incapacidade funcional. De etiologia ainda pouco esclarecida, sua prevalência é de cerca de 0,46% no Brasil e 1% no mundo, com ocorrência maior entre as mulheres. Diversos tipos celulares estão envolvidos na patogênese da AR, porém os fibroblastos sinoviais (FLS) se destacam por apresentarem um fenótipo agressivo que medeia a inflamação e a destruição articular. Apesar dos avanços no tratamento da AR, estes apresentam significativos efeitos adversos, altos custos e limitações, salientando a necessidade da busca por novas estratégias terapêuticas. A Fasciola hepatica (F. hepatica) é um helminto causador da doença fasciolose em ruminantes e humanos. Através de produtos excretores-secretores e antígenos do tegumento, a F. hepatica apresenta propriedades imunomoduladoras, as quais já foram estudadas em diferentes tipos celulares, mas não em FLS. Diante disso, avaliamos nesse trabalho o potencial terapêutico in vitro do extrato de F. hepatica em FLS isolados de camundongos com artrite induzida por colágeno. A viabilidade celular dos FLS foi determinada por ensaio de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], em que os FLS foram expostos ao extrato de F. hepatica nas concentrações de 60μg/ml, 80μg/ml e 100μg/ml, por 24h, 48h e 72h. A capacidade de aderência dos FLS foi avaliada pela exposição das células ao extrato de F. hepatica na concentração de 100μg/ml por 24h. Os efeitos a longo prazo do tratamento com o extrato de F. hepatica na FLS foram avaliados utilizando o ensaio cumulativo de duplicação da população (CDP) após exposição dos FLS a 100μg/ml de extrato de F. hepatica durante 24h. As células foram contadas a cada 2 dias e replaqueadas na mesma concentração inicial por 8 dias. A liberação de interleucina-6 (IL-6) foi avaliada pelo ensaio de ELISA, para este ensaio os FLS também foram expostos ao extrato de F. hepatica na concentração de 100μg/ml por 24h e, após, foram estimulados com o fator de necrose tumoral α (TNF- α). O extrato de F. hepatica foi capaz de diminuir a viabilidade celular em 48h com a concentração de 100μg/ml quando comparado com o grupo DMEM (p<0.05). Em 72h, as doses de 60μg/ml (p <0,001), 80μg/ml (p <0,001) e 100μg/ml (p <0,0001) do extrato de F. hepatica diminuíram a viabilidade celular quando comparadas com o grupo DMEM. O tratamento com 100μg/ml do extrato por 24h apresentou uma tendência no aumento da liberação de IL-6 pelos FLS quando comparados com o grupo DMEM estimulado. No entanto, o extrato não alterou a capacidade de aderência e o crescimento a longo prazo dos FLS. A partir desses resultados, pode-se concluir que o extrato de F. hepatica não apresentou efeito sobre a aderência e o crescimento ao longo do tempo dos FLS, porém apresentou efeito na viabilidade dos FLS e foi capaz de aumentar a liberação de IL-6 pelos FLS. Portanto, embora esses resultados sejam preliminares, eles são importantes para entender a ação do extrato da F. hepatica nos FLS e indicam um efeito imunomodulatório do extrato sobre os FLS.

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune, chronic and systemic disease, where the inflammation of synovial joints leads to degradation of cartilage and bone, resulting in joint destruction, pain and functional disability. The prevalence of disease is around 0.46% in Brazil and 1% in the world, with a higher occurrence among women. Several cell types are involved in the pathogenesis of RA and fibroblast-like synoviocytes (FLS) have a central role mediating inflammation and joint destruction because of its aggressive phenotype. Despite advances in the treatment of RA, there are still significant adverse effects, high costs and limitations, emphasizing the need to search for new therapeutic options. Fasciola hepatica (F. hepatica) is a helminth that causes fasciolosis in ruminants and humans. Through excretory-secretory products and tegument antigens, F. hepatica presents immunomodulatory properties, which have already been studied in different cell types, but not in FLS. In this work, we evaluated the in vitro therapeutic potential of F. hepatica extract in FLS isolated from mice with collagen-induced arthritis. Cell viability of FLS was determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay, in which FLS were exposed to extract of F. hepatica at concentrations of 60μg/ml, 80μg/ml and 100μg/ml, for 24h, 48h and 72h. Adherence capacity of FLS was evaluated by exposing the cells to the extract of F. hepatica at a concentration of 100μg/ml for 24h. The long-term effects of treatment with F. hepatica extract on FLS were evaluated using the cumulative population doubling test (CDP) after exposure of FLS to 100μg/ml of F. hepatica extract for 24h. The cells were count every 2 days and were re-plated at the same initial density for 8 days. The release of interleukin-6 (IL-6) was evaluated by the ELISA assay. For this assay, FLS were exposed to 100μg/ml of extract of F. hepatica for 24h and then were stimulated with tumor necrosis factor (TNF-α). Extract of F. hepatica was able to decrease cell viability in 48h with the concentration of 100μg/ml when compared to DMEM group (p <0.05). In 72h, doses of 60μg/ml (p <0.001), 80μg/ml (p <0.001) and 100μg/ml (p <0.0001) of F. hepatica extract decreased cell viability when compared to DMEM group. Treatment with 100μg/ml of F. hepatica extract for 24h showed a tendency to increase IL-6 release by FLS when compared to stimulated DMEM. However, the extract did not alter adhesion capacity and long-term growth of FLS. In conclusion, extract of F. hepatica had no effect on adherence and growth over time of FLS, but showed an effect on the viability of FLS and was able to increase the release of IL-6 by FLS. Therefore, although these results are preliminary, they are important for understanding the action of F. hepatica extract on FLS and indicate an immunomodulatory effect of the extract on FLS.