Comparação de diferentes soluções para preservação do DNA de amostras citológicas bucais

Abstract

Introdução: O processo da carcinogênese é desencadeado pelo acúmulo de mutações genéticas. Por isso, o uso de testes que identifiquem essas alterações, pode ser um valioso preditor de risco para o câncer de boca. O DNA isolado de células bucais esfoliadas pode ser empregado com sucesso para tal fim. Para isso, a utilização de soluções de preservação de DNA formuladas em laboratório, a um baixo custo e que garantam a viabilidade do material coletado pode ser um fator contribuinte para emprego destes testes em grande escala populacional. Objetivo: Avaliar a preservação do DNA de células bucais esfoliadas mantidas em soluções de preservação formuladas em laboratório em comparação com uma solução comercial e uma solução tampão. Materiais e Métodos: Foram manipuladas soluções de preservação de DNA: Nucleic Acid Preservation Buffer (NAP), Dimethyl sulphoxide disodium-EDTA-satured NaCl (DESS) e Tris-EDTA-NaCl-Tween20 buffer (TENT) e uma solução tampão phosphate buffered saline (PBS). Utilizou-se também a solução comercial Liqui-PREP (LP). As células esfoliadas da mucosa jugal foram divididas em cinco grupos: PBS, LP, NAP, DESS e TENT. As amostras foram mantidas em temperatura ambiente ou a 4°C durante os tempos: 0h, 24h, 72h, 7 dias, 30 dias, 90 dias, 180 dias e 360 dias. O DNA foi extraído através do QIAamp DNA mini Kit. A quantificação e pureza do DNA amostral foram mensuradas através do espectrofotômetro de microvolume NanoDrop e análise fluorométrica QuBit. Por último, o DNA foi analisado quanto a sua integridade pela eletroforese em gel de agarose e amplificação através das reação em cadeia da polimerase (PCR). Resultados: a quantidade de DNA obtida flutuou ao longo do tempo, mas em geral o PBS forneceu maiores quantidades, seguido das soluções DESS e TENT. Melhores níveis de pureza foram obtidos pela solução PBS. A solução DESS resultou em mais amostras com DNA íntegro, e o número de amostras com integridade aceitável foi maior no período até 30 dias. A amplificação por PCR para o primer IFNA foi possível para amostras armazenadas por até 7 dias. Conclusão: a solução DESS é a mais adequada para a obtenção de DNA a partir de amostras citológicas bucais e estas podem ser armazenadas em 4°C ou temperatura ambiente por até 7 dias

Introduction: The carcinogenesis process is triggered by the accumulation of genetic mutations. Therefore, the use of specific tests to identify these changes can be a valuable predictor of risk for oral cancer. DNA isolated from exfoliated buccal cells can be successfully employed for this purpose. For this reason, the use of low-cost laboratory-formulated DNA preservation solutions that guarantee the viability of the collected sample may be a contributing factor for the use of these tests in large-scale population. Aim: Evaluate the preservation capacity of exfoliated buccal cells DNA among different laboratory formulated preservation solutions compared to a commercial solution and a buffer solution. Methods: The following DNA preservation solutions were manipulated: Nucleic Acid Preservation Buffer (NAP), Dimethyl sulphoxide disodium-EDTA-saturated NaCl (DESS) and Tris-EDTA-NaCl-Tween20 buffer (TENT) and a phosphate buffered saline buffer (PBS). The commercial solution Liqui-PREP was also used. Exfoliated cells of the buccal mucosa were divided into five groups: PBS, LP, NAP, DESS and TENT. They were kept at room temperature and at 4 ° C during the times: 0h, 24h, 72h, 7 days, 30 days, 90 days, 180 days and 360 days. The DNA was extracted with the QIAamp DNA mini Kit. The quantification and purity of the DNA sample were measured using the NanoDrop microvolume spectrophotometer and Qubit fluorometric analysis. Finally, DNA was analyzed for integrity by agarose gel electrophoresis and amplification through polymerase chain reaction (PCR). Results: The amount of DNA obtained fluctuated over time, however, in most of the samples, PBS provided larger amounts of DNA, followed by DESS and TENT solutions. Best purity levels were obtained by the PBS solution, and within 30 days. The DESS solution resulted in more samples with intact DNA, and the number of samples with acceptable integrity was higher up to 30 days. PCR amplification for the IFNA primer was possible for samples stored for up to 7 days. Conclusion: DESS solution is the most suitable for obtaining DNA from oral cytological samples and these can be stored at 4 C or room temperature for up to 7 days