Cultura organotípica hipocampal de ratos Wistar Kyoto : perfil celular e efeito da guanosina sobre a captação de glutamato

Abstract

A cultura de células primárias in vitro é uma técnica bem estabelecida e utilizada por diversos grupos de pesquisa por todo o mundo. Nesta metodologia, pode-se compreender a forma que diferentes células, como neurônios, glia ou mesmo células do sistema periférico, se comportam frente a diferentes insultos ou mesmo no estudo de drogas ou fármacos em um ambiente isolado. Contudo, culturas de células primárias não refletem de forma fiel como o tecido original se comporta devido à falta de contato com outros tipos celulares. Na tentativa de superar este desafio, culturas tridimensionais foram desenvolvidas com o intuito de serem um modelo intermediário entre culturas de células primárias e experimentos in vivo. Dentre elas, a técnica da cultura organotípica mantém todos tipos celulares presentes no tecido, preserva a citoarquitetura tridimensional original bem como a comunicação entre estas células. Culturas organotípicas podem ser realizadas a partir de explante de tecido periférico, mas é no sistema nervoso central que há um maior interesse e investigação pela tentativa de melhor compreender mecanismos celulares de diferentes regiões cerebrais, entre elas, o hipocampo, devido a sua importância na consolidação da memória e aprendizado. Assim sendo, esta metodologia oferece possibilidades de estudo da fisiopatologia de diferentes modelos de doenças cerebrais e, para além disso, a cultura organotípica também nos permite a investigação de substâncias ou fármacos com potencial efeito neuroprotetor. Porém, mesmo com a infinidade de trabalhos utilizando esta técnica para fins de estudos de neurodegeneração/neuroproteção, pouco se sabe como células neuronais e gliais se apresentam durante o desenvolvimento e amadurecimento do hipocampo em cultura, sendo este então, o objetivo da presente dissertação. Além disso, nos propusemos a investigar a viabilidade celular e o efeito da guanosina sobre a captação de glutamato nas culturas. Com isso, entre outros resultados, este trabalho demonstrou que as fatias organotípicas hipocampais de ratos Wistar Kyoto neonatos machos e fêmeas possuem uma viabilidade duradoura (28 dias) em cultura por não captarem iodeto de propídeo e também possuem mitocôndrias viáveis e funcionais demonstradas através de marcadores específicos. Quanto ao perfil celular destas fatias foi observado, através de citometria de fluxo, uma diminuição de células marcadas para as proteínas NeuN (neurônios) e GFAP (astrócitos) em machos após 28 dias de cultura, porém sem haver alteração na relação destas células (NeuN+/GFAP+) nos dias 1 e 28 de cultura. Verificamos um possível indicador de reatividade astrocitária foi observado através do aumento da complexidade das células que expressam GFAP para machos e fêmeas em cultura. Quanto à captação de glutamato, verificamos, em machos, que a adição de guanosina foi capaz de prevenir a diminuição da captação no 28º dia de cultura, indicando um potencial efeito neuroprotetor via atenuação de potencial excitotoxicidade glutamatérgica. Assim sendo, mais resultados são necessários para elucidação de algumas hipóteses apresentadas neste trabalho, mas, de antemão, podemos concluir que a cultura organotípica é uma excelente ferramenta in vitro para estudarmos diferentes regiões cerebrais e suas vias de sinalização em diversos modelos de intervenções in vivo (exercício, dieta, entre outras) e in vitro, incluindo estratégias neuroprotetoras frente a modelos de injúria cerebral.

In vitro primary cell culture is a well-established technique used by several research groups around the world. In this methodology, it is possible to understand the way that different cells, such as neurons, glia or even cells of the peripheral system, behave in the face of different insults or even in the study of drugs or substances in an isolated environment. However, primary cell cultures do not accurately reflect how the original tissue behaves due to lack of contact with other cell types. In an attempt to overcome this challenge, three-dimensional cultures were developed in order to be an intermediate model between primary cell cultures and in vivo experiments. Among them, the organotypic culture technique maintains all cell types present in the tissue, preserves the original three-dimensional cytoarchitecture as well as the communication between these cells. Organotypic cultures can be performed from peripheral tissue explants, but it is in the central nervous system that there is greater interest and investigation in an attempt to better understand cellular mechanisms of different brain regions, including the hippocampus, due to its importance in consolidation of memory and learning. Therefore, this methodology offers possibilities for studying the pathophysiology of different models of brain diseases and, in addition, organotypic culture also allows us to investigate substances or drugs with a potential neuroprotective effect. However, even with the infinity of works using this technique for purposes of neurodegeneration/neuroprotection studies, little is known about how neuronal and glial cells present themselves during the development and maturation of the hippocampus in culture, which is then the objective of the present dissertation. In addition, we investigated cell viability and the effect of guanosine on glutamate uptake in cultures. Thus, among other results, this work demonstrated that organotypic hippocampal slices from male and female neonate Wistar Kyoto rats have a long-lasting viability (28 days) in culture because they do not capture propidium iodide and also have viable and functional mitochondria demonstrated through markers specific. As for the cellular profile of these slices, a decrease in NeuN- (neurons) and GFAP- (astrocytes) labeled cells in males after 28 days of culture was observed through flow cytometry, but there was no change in the ratio of these cells (NeuN+/GFAP+) on days 1 and 28 of culture. We verified a possible indicator of astrocyte reactivity was observed through the increase in the complexity of GFAP-expressing cells for males and females in culture. As for glutamate uptake, we found in males that the addition of guanosine was able to prevent a decrease in uptake on the 28th day of culture, indicating a potential neuroprotective effect through attenuation of potential glutamatergic excitotoxicity. Therefore, more results are needed to elucidate some hypotheses presented in this work, but, beforehand, we are possible to conclude that organotypic culture is an excellent in vitro tool to study different brain regions and their signaling pathways in different models of in vivo interventions (exercise, diet, among others) and in vitro, including neuroprotective strategies against brain injury models.