Análise do transcriptoma de genes responsáveis pela tolerância ácida em Streptococcus mutans presentes em superfícies radiculares hígidas e com lesão de cárie

Abstract

Nas últimas décadas inúmeros estudos estão sendo realizados para melhor entendimento sobre os principais microrganismos envolvidos na etiopatogenia da cárie radicular. Uma atenção é dada ao Streptococcus mutans, pelo fato desde microrganismo ser isolado de biofilmes associado a lesões de cárie com bastante frequência e apresenta características imprescindíveis para desenvolvimento da doença, como a capacidade de produção de ácidos (acidogenicidade) e de tolerância à ambientes ácidos (aciduricidade). Evidências acerca dos mecanismos de tolerância ácida utilizados pelos S. mutans foram obtidas a partir de estudos in vitro nos quais essas bactérias foram analisadas isoladamente e sob condições experimentais laboratoriais. Considerando a complexidade microbiana dos biofilmes dentais e potenciais interações microbianas que ocorrem nesse ambiente microbiologicamente diverso, torna-se necessário analisar quais os mecanismos de tolerância ácida estão sendo expressos em biofilme polimicrobiano obtidos de amostras clínicas. Sendo assim, o objetivo desde trabalho foi de avaliar a expressão diferencial de genes envolvidos nos mecanismos de tolerância ácida de S. mutans através da análise de transcriptoma de biofilmes naturais de superfícies radiculares hígidas (n=10, SRS) e de biofilme e dentina radicular ativa (n=9, RC). O RNA total microbiano foi extraído e o mRNA isolado e sequenciado na plataforma Illumina Hi-Seq2500. Foram formados pool (grupamentos) das amostras com valores inferiores a 30ng/RNA para a construção de bibliotecas genômicas. Os dados gerados pelo sequenciamento de RNA-Seq foram compilados em uma tabela de contagem (reads) e mapeados com o genoma de referência (S. mutans UA159). Para o cálculo do nível de expressão gênica os dados foram normalizados com o algoritmo DESeq. Os genes que apresentaram expressão diferencial em superfícies radiculares cariadas foram analisados para uma melhor compreensão da sua importância para adaptação de S. mutans a um ambiente ácido. 69 genes apresentaram expressão diferencial em RC, e nenhum gene apresentou expressão diferencial SRS. Os principais mecanismos que apresentaram expressão diferencial relacionados com a tolerância de S. mutans ao ambiente ácido foram: genes associados ao metabolismo e transporte de açúcares, metabolismo de nucleotídeos e nucleosídeos, biossíntese de V aminoácidos, atividade de membrana plasmática, genes relacionados à comunicação celular e resposta á fatores externos, genes relacionados ao controle do pH extracelular e genes relacionados à mecanismos de reparos á macromoléculas. Estes resultados elucidam os principais genes responsáveis pela tolerância ácida de S. mutans em amostras clinicas.

In the last decades countless studies are being carried out to better understand the main microorganisms involved in the etiopathogenesis of root caries. Attention is given to Streptococcus mutans, since microorganism is isolated from biofilms associated with caries lesions quite frequently and presents essential characteristics for the development of the disease, such as acid production capacity (acidogenicity) and tolerance to acid environments (aciduricity). Evidence about the acid tolerance mechanisms used by S. mutans was obtained from in vitro studies in which these bacteria were analyzed separately and under experimental laboratory conditions. Considering the microbial complexity of dental biofilms and potential microbial interactions that occur in this microbiologically diverse environment, it is necessary to analyze which mechanisms of acid tolerance are being expressed in polymicrobial biofilm obtained from clinical samples. Thus, the objective of this work was to evaluate the differential expression of genes involved in the mechanisms of acid tolerance of S. mutans by transcriptome analysis of natural biofilms of sound root surfaces (n = 10, SRS) and biofilm and root dentin active (n = 9, RC). Total microbial RNA was extracted and mRNA isolated and sequenced on the Illumina Hi-Seq2500 platform. Pooling of samples with values below 30ng / RNA was formed for the construction of genomic libraries. Data generated by RNA-Seq sequencing was compiled into a table of reads (reads) and mapped to the reference genome (S. mutans UA159). For the calculation of gene expression level the data were normalized with the DESeq algorithm. Genes that showed differential expression on decayed root surfaces were analyzed for a better understanding of their importance for adaptation of S. mutans to an acidic environment. 69 genes showed differential expression in CR, and no gene showed differential expression SRS. The main mechanisms that showed differential expression related to S. mutans tolerance to the acid environment were: genes associated with sugar metabolism and transport, nucleotide and nucleoside metabolism, amino acid biosynthesis, plasma membrane activity, genes related to cellular communication and response to external factors, genes related to extracellular pH control and genes related to macromolecule repair mechanisms. These VII results elucidate the main genes responsible for acid tolerance of S. mutans in clinical samples.