Caracterização molecular e funcional do gene ATPLAC811.1 na morte celular programada (programmed cell death) em plantas

Abstract

O processo celular denominado de morte celular programada (do inglês, Programmed Cell Death) corresponde ao suicídio celular de maneira geneticamente controlada e regulada em organismos eucarióticos e procarióticos, de modo a eliminar células danificadas, senescentes ou desnecessárias. Em plantas, a PCD ocorre durante etapas do desenvolvimento, nas respostas de defesa e frente a condições ambientais adversas. Ao contrário dos animais, o conhecimento sobre a PCD em plantas é limitado, com trabalhos realizados principalmente utilizando a planta Arabidopsis thaliana como modelo. Nessa planta foi sugerida uma rede que controla a morte celular mediada por resposta hipersensível (do inglês, Hypersensitive Response), o "AtLSD1 - deathosome". O gene codificador de proteína contendo o domínio PLAC8 (Placenta-specific 8), At1g52200 (AtPLAC8-11), foi descrito como componente do "AtLSD1-deathosome". O presente trabalho tem como objetivo o estudo funcional do gene AtPLAC8-11, especialmente em relação a PCD. Para isso, foram realizados estudos de localização subcelular dos produtos do gene AtPLAC8-11: AtPLAC8-11.1 (transcrito canônico) e AtPLAC8-11.2 (transcrito alternativo) em protoplastos e verificou-se um perfil diverso de localização das proteínas em ambas as variantes de acordo com a fusão C ou N-terminal com GFP (do inglês, Green Fluorescent Protein). Porém, foi possível obter co-localização com o marcador de retículo endoplasmático para ambas as formas. A expressão tecido-específica de AtPLAC811.1 e AtPLAC811.2 sob controle do promotor nativo em Arabidopsis foi observada em raiz e folha, com diferente localização subcelular nesses tecidos, como nas bases dos tricomas apenas para AtPLAC811.1. A análise da expressão de AtPLAC811.1 e AtPLAC811.2 sob controle do promotor nativo em diferentes partes da flor mostrou que AtPLAC811.1 é altamente expresso em sépalas e estames, em comparação com AtPLAC811.2. O tratamento com o indutor de resistência ou elicitor Pep1 aumentou a expressão tanto de AtPLAC811.1 quanto AtPLAC811.2 sob controle do promotor nativo nas raízes. O ensaio de duplo híbrido em levedura (YH2) (do inglês, Yeast Two-Hybrid) revelou que apenas AtPLAC811.1 interage com a proteína AtLSD1 e através do ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC), observou-se reconstituição da YFP (do inglês, Yellow Fluorescent Protein) em formato indefinido em locais da célula. Os experimentos de transativação mostraram que a interação de AtPLAC811.1 com AtLSD1 é capaz de interferir na atividade transcricional de AtLSD1. As plantas knockout plac8- 11 alteram a expressão de genes relacionados a PCD do desenvolvimento (dPCD) e do ambiente (ePCD). Um método promíscuo de biotina ligase TurboID foi utilizado para investigar os interatores de AtPLAC811.1 e AtPLAC811.2, resultando na identificação de diferentes proteínas interatoras, incluindo proteínas envolvidas em resposta a estresses para ambas as variantes. Nesse sentido, os resultados obtidos indicam o envolvimento de AtPLAC8-11 no processo de PCD em Arabidopsis.

The cellular process denominated Programmed Cell Death (PCD) corresponds to cell suicide in a genetically controlled and regulated manner in eukaryotic and prokaryotic organisms, in order to eliminate damaged, senescent or unnecessary cells. In plants, PCD occurs during developmental stages, in defense responses and in adverse environmental conditions. Unlike animals, the knowledge about PCD in plants is limited, with works mainly performed using Arabidopsis thaliana as a model. In this plant, a network that controls cell death mediated by a Hypersensitive Response (HR) has been suggested, the "AtLSD1 - deathosome". The protein- coding gene containing the PLAC8 (Placenta-specific 8) domain, At1g52200 (AtPLAC8-11), has been described as a component of the "AtLSD1-deathosome". The present work aims at the functional study of the AtPLAC8-11 gene, especially in relation to PCD. For this, studies of subcellular localization of AtPLAC8-11 gene products: AtPLAC8-11.1 (canonical transcript) and AtPLAC8-11.2 (alternative transcript) in protoplasts were carried out and a diverse profile of protein localization was verified in both variants of according to C- or N-terminal fusion with Green Fluorescent Protein (GFP). However, co-localization with the endoplasmic reticulum marker was possible for both forms. Tissue-specific expression of AtPLAC811.1 and AtPLAC811.2 under native promoter control in Arabidopsis was observed in root and leaf, with different subcellular localization in these tissues, as in the trichome bases only for AtPLAC811.1. Analysis of the expression of AtPLAC811.1 and AtPLAC811.2 under native promoter control in different parts of the flower showed that AtPLAC811.1 is highly expressed in sepals and stamens, compared to AtPLAC811.2. Treatment with the resistance inducer or Pep1 elicitor increased the expression of both AtPLAC811.1 and AtPLAC811.2 under the control of the native promoter in the roots. The Yeast Two-Hybrid (YH2) assay revealed that only AtPLAC811.1 interacts with the AtLSD1 protein and through the Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assay, Yellow Fluorescent Protein (YFP) reconstitution was observed in undefined shape at locations in the cell. The transactivation experiments showed that the interaction of AtPLAC811.1 with AtLSD1 is capable of interfering with the transcriptional activity of AtLSD1. The plac8-11knockout plants alter the expression of genes related to developmental (dPCD) and environmental (ePCD) PCD. A promiscuous TurboID biotin ligase method was used to investigate the AtPLAC811.1 and AtPLAC811.2 interactors, resulting in the identification of different interacting proteins, including proteins involved in stress response for both variants. In this sense, the results obtained indicate the involvement of AtPLAC8-11 in the PCD process in Arabidopsis.