Aplicando a tecnologia arming yeasts na indústria cervejeira : uso da fusão AGA1- AGA2-GFP para detecção da viabilidade celular em Saccharomyces cerevisiae

Abstract

O reuso da biomassa de leveduras é uma tendência importante dentro da indústria cervejeira, pois as leveduras constituem um dos insumos mais caros dentre aqueles usados para a fabricação de cervejas. Além disso, a biomassa de leveduras é um dos principais efluentes orgânicos poluidores da indústria cervejeira. Desta maneira, o reuso de leveduras é parte da busca do setor cervejeiro por técnicas que reduzam os custos de produção e que gerem um menor impacto ambiental. Porém, o reuso da biomassa depende da análise da viabilidade (definido como a atividade de propagação) e da vitalidade (definida como a atividade fermentativa) das leveduras após um processo fermentativo. É sabido que a fermentação cervejeira constitui uma fonte importante de diferentes estresses fisiológicos, dentre eles o estresse induzido pela alta concentração de etanol, que resulta em uma baixa viabilidade e vitalidade das células e que afetam negativamente o reuso desta biomassa. Para determinar a viabilidade e a vitalidade da biomassa, diferentes técnicas são empregadas, tais como o método de coloração com azul de metileno e os testes de poder de acidificação, respectivamente. Entretanto, estes métodos não permitem acompanhar em tempo real as mudanças fisiológicas que acontecem na biomassa durante a fermentação cervejeira. Além disso, dentro de uma cervejaria, há a necessidade do emprego de técnicas que sejam diretas e rápidas para avaliar a qualidade da biomassa. Dessa maneira, a ideia central deste projeto foi a de empregar a tecnologia de leveduras armadas como um sistema indicador de viabilidade e de vitalidade. A tecnologia de leveduras armadas é uma estratégia baseada na exposição de peptídeos ou proteínas de interesse na superfície celular de leveduras usando genes sintéticos que codificam para a fusão de uma proteína âncora de membrana com uma proteína de interesse a ser exposta. Sendo assim, nesse projeto foram usadas técnicas de biologia sintética para a geração de um sistema de monitoramento da viabilidade e da vitalidade celular em leveduras cervejeiras empregando o complexo heterodimérico Aga1p/Aga2p fusionado à proteína fluorescente verde (GFP). Para tanto, um sistema de expressão induzido por etanol foi inicialmente desenhado in silico e posteriormente sintetizado in vitro, consistindo em um promotor sintético mínimo derivado do gene CYC1 de S. cerevisiae fusionado à montante com elementos de DNA responsivos à choque 8 térmico e etanólico derivados do gene SSA4 também de S. cerevisiae. Esta construção contém, à jusante ao promotor sintético, a região codificadora para a fusão Aga2p e GFP, bem como para a subunidade Aga1p, ambas clonadas separadamente em vetores bifuncionais para leveduras e bactérias, usando a tecnologia de concatenação de fragmentos de DNA. Espera-se que estes vetores possam indicar, de uma forma rápida e em tempo real, o estado fisiológico das leveduras cervejeiras para o seu reuso em um novo processo fermentativo cervejeiro.

The reuse of yeast biomass is an important trend within the brewing industry as yeasts are one of the most expensive components of beers. In addition, the yeast biomass is the main polluting effluent generated by the brewing industry. The reuse of yeast biomass is a central part of the development of new cost-cutting techniques with lower environmental impact. However, the reuse of yeast biomass depends on the analysis of the viability (defined as the propagation activity) and the vitality (defined as the fermentative activity) of the yeasts after a fermentative process. It is known that beer fermentation constitutes an important source of different physiological stresses, among them the stress induced by the high concentration of ethanol, which leads to a low cell viability and vitality, negatively affecting its reuse. To determine the biomass viability and vitality, different techniques are employed, such as the methylene blue staining method and acidification power test, respectively. However, these methods do not allow to monitor the physiological changes that happen in the biomass during beer fermentation in real time. In addition, there is a need to employ techniques that directly and quickly assess the quality of biomass. Thus, the purpose of this project was to employ the armed yeasts technology as a potential indicator of cell viability and vitality. The armed yeast technology is a strategy based on the exposure of peptides or proteins of interest on the yeast cell surface using synthetic genes containing the coding sequence for a fusion between a membrane anchor protein and the protein of interest. In this work synthetic biology techniques were used to generate a monitoring system using the Aga1p-Aga2p heterodimeric complex fused to the green fluorescent protein (GFP). This task was accomplished by the design of an ethanol-induced expression system in silico and then synthesized in vitro, which consists of a minimal synthetic promoter derived from the S. cerevisiae CYC1 gene combined upstream with heat shock and ethanol-responsive DNA sequences derived from S. cerevisiae SSA4 gene. In addition, this system also contains downstream the coding region for the Aga2p and GFP fusion, as well as the coding sequence for the Aga1p subunit, both cloned separately in bifunctional vectors for yeasts and bacteria using the DNA fragment concatenation technology. It is expected that these vectors could indicate in real time the physiological state of brewing yeasts for their potential reuse.