Avaliação in vitro de atividade antitumoral e toxicidade de híbridos cumarina-triazol

Abstract

Muitos métodos alternativos tem sido validados para detectar toxicidade o mais cedo possível e assim diminuir o desperdício de recursos e esforços na pesquisa da química medicinal, modelos alternativos in vivo são especialmente valiosos pela quantidade de informação que eles podem providenciar por um baixo custo e em pouco tempo. O nosso grupo de pesquisa escreveu uma revisão da literatura publicada esse ano sobre métodos alternativos in vivo para screening de toxicidade usados na química medicinal. Esses modelos in vivo incluem o zebrafish, Artemia salina, Galleria mellonella, Drosophila melanogaster, planárias, e o Caenorhabditis elegans. Chamamos atenção para o C. elegans por causa de sua popularidade em ascensão, uma vasta gama de usos, e seus resultados rápidos e confiáveis. Com o passar do tempo, o C. elegans virou uma opção para screening de fármacos de alta eficiência (HTS). Este manuscrito também lista brevemente outros métodos de screening usados para análises toxicológicas iniciais e o papel de métodos alternativos in vivo nestes cenários, classificando-os em modelos in silico, in vitro e in vivo que tem recebido um interesse crescente nos últimos anos. Paralelamente, quatro híbridos cumarina-triazol foram sintetizados usando himecromona como precursor e testadas para a avaliarmos a atividade antitumoral em linhagens celulares A549 (câncer de pulmão), HepG2 (câncer de fígado), J774A1 (macrófago de sarcoma de camundongo), MCF7 (câncer de mama), OVACAR (cancer de ovário), RAW (macrófago de leucemia murina), Siha (carcinoma de útero) e 3T3 (fibroblastos saudáveis). Avaliamos a citotoxicidade através de ensaios como MTT e vermelho neutro (VN), além de efeitos antioxidantes e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) através do ensaio diacetato de 2’7’-diclorodihidrofluoresceina (DCF-DA), dano na membrana mitocondrial pelo ensaio etil ester de tetrametilrodamina (TMRE), apoptose/necrose pelo ensaio Anexina V-FITC/PI e dano no DNA pelo ensaio cometa alcalino. Os híbridos demonstraram atividade potente dentre as linhagens celulares testadas com IC50 abaixo de 100 μM, com seletividade melhor que o fármaco de referência cisplatina, todos tiveram boa predição farmacocinética pelo programa SwissADME e causaram morte por apoptose. Duas das moléculas avaliadas demonstraram atividade antioxidante e três interromperam o potencial de membrana mitocondrial, além disso, nenhuma causou dano genotóxico nas células 3T3. Todos os híbridos estudados possuem potencial para serem leads.

Many alternative methods have been validated to detect toxicity as early as possible to diminish the waste of resources and efforts in medicinal chemistry research, and in vivo alternative methods are especially valuable for the amount of information they can provide at little cost and in a short time. We present a review of the literature published between the years 2000 and 2021 on in vivo alternative methods of toxicity screening employed in medicinal chemistry. These in vivo models include zebrafish, Artemia salina, Galleria mellonella, Drosophila melanogaster, planarians, and Caenorhabditis elegans. Special attention is given to C. elegans because of its rising popularity, a wide range of uses, and its fast and reliable results. Over time, C. elegans also became a viable high-throughput (HTS) automated drug screening option. Additionally, this manuscript lists briefly the other screening methods used for the initial toxicological analyses and the role of alternative in vivo methods in these scenarios, classifying them as in silico, in vitro and alternative in vivo models that have been receiving a growing increase in interest in recent years. Four coumarin-triazoles were synthesized using hymechromone as a precursor and tested for antitumor activity on A549 (lung cancer), HepG2 (liver cancer), J774A1 (mouse sarcoma macrophage), MCF7 (breast cancer), OVACAR (ovarian cancer), RAW (murine leukaemia macrophage), Siha (uterus carcinoma) and toxicity on 3T3 (healthy fibroblasts) cell lines via MTT and neutral red (NR) assays; besides effect on reactive oxygen species (ROS) production and antioxidant activity via 2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) assay, mitochondrial membrane disruption activity via tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) assay, apoptosis/necrosis evaluation via annexin V-FITC/PI assay and DNA damage via alkaline comet assay. The hybrids showed potent antitumor activity with IC50 below 100 μM across all the cell lines tested, with better selectivity index than the reference drug cisplatin, all of them had good pharmacokinetic predictions via the SwissADME program and caused death by apoptosis induction. Two showed antioxidant activity in vitro and three disrupted the mitochondria membrane, besides none causing genotoxic damage on healthy cells. All of the hybrids may become potential leads, and further studies of rearrangement, elucidation of mechanism of action and evaluation of in vivo activity and toxicity of these molecules can be carried out.