Efeito do transplante de células mononucleares da medula óssea na frequência de crises e no desempenho cognitivo de ratos com epilepsia induzida por lítio-pilocarpina

Abstract

A epilepsia atinge cerca de 1% da população mundial, sendo que aproximadamente 30% desses pacientes não respondem ao tratamento medicamentoso. Por sua vez, as células-tronco representam uma esperança de tratamento da epilepsia, visto que têm grande capacidade de proliferação, diferenciação e regeneração de tecidos, podendo restaurar circuitos neurais e restabelecer a excitabilidade neuronal fisiológica. O objetivo deste estudo é verificar se as células mononucleares da medula óssea (CMMO) apresentam potencial terapêutico no controle das crises epilépticas e do dano neuronal progressivo induzido pela epilepsia experimental. Os animais foram injetados com lítio-pilocarpina (127 mg/kg e 60 Mg/kg i.p., respectivamente) para indução de status epilepticus (SE). As crises comportamentais foram classificadas de acordo com a escala de Racine e a duração do SE foi controlada com diazepam (10 mg/kg, i.p., 90 minutos). Os animais controle receberam solução salina. Após 22 dias, o total dos animais foi dividido em quatro grupos: Pilocarpina; Pilocarpina + CMMO, Salina e Salina + CMMO. Os grupos CMMO receberam transplante de células da camada mononuclear da medula óssea, obtidas de camundongos EGFP C57BL/6, via veia caudal (107 células, 200L), e os demais salina. Os animais tratados com pilocarpina foram monitorados por vídeo durante sete dias pré-transplante e outros catorze dias após o procedimento, para observação e computação de crises espontâneas recorrentes (CERs). Ainda, 45 dias depois da injeção das células os animais foram avaliados na tarefa do labirinto aquático de Morris (LAM) e a seguir na tarefa de reconhecimento de objetos, e logo após utilizou-se o teste do eletrochoque máximo para avaliação do limiar convulsivo. Decorridos sete meses do transplante os animais foram sacrificados e foram coletados os hipocampos direito e esquerdo, e amostras de cerebelo, bulbo olfatório, coração, pulmão e fígado para análise da presença de EGFP por PCR. Nossos resultados demonstram que os animais tratados com pilocarpina que receberam injeção de CMMO têm melhor desempenho no LAM quando comparados com o grupo pilocarpina. Esta melhora foi significativa durante o primeiro e último dias de treino, e também durante o teste em todos os parâmetros avaliados: latência, número de cruzamentos e permanência no quadrante alvo. Ainda, as CMMO reduziram o número de crises. Entretanto, na tarefa de reconhecimento de objetos e no teste do eletrochoque máximo não há diferença entre os animais epilépticos tratados ou não com CMMO. Finalmente, não foram detectadas bandas correspondentes à EGFP em nenhuma das amostras estudadas. Nos últimos anos, estudos que buscam tratamentos baseados em células-tronco para as mais diversas doenças neurodegenerativas foram vistos com muito interesse. Este tipo de tratamento pode ser útil também no tratamento da epilepsia crônica, dado o potencial que estas células têm de, independentemente do mecanismo, restaurar o micro ambiente neuronal e re-estabelecer a excitabilidade neuronal fisiológica. Palavras-chave: Epilepsia, células-tronco, testes comportamentais.

Epilepsy affects 1% of the world population and 30% of these patients are refractory to medication now available. Stem cells host hope in the treatment of epilepsy. Given their ability to proliferate, differentiate and regenerate tissues they could fix neural circuits and reestablish the physiological excitability of neurons. This study aimed to verify the therapeutic potential of bone marrow mononuclear cells (BMMC) on seizure control and on progressive neuronal loss induced by experimental epilepsy. Experimental status epilepticus (SE) was induced by lithium-pilocarpine injection (127 mg/kg; ip and 60 mg/kg; ip respectively). Seizures were scored by Racine’s scale. The duration of SE was controlled with diazepan (10mg/kg; ip; 90 minutes after SE onset). Control animals received saline other than pilocarpine. Twenty-two days after SE, rats were randomly assigned into four groups: Pilocarpina; Pilocarpine+BMMC; Control and Control+BMMC. BMMC groups received cell transplantation (obtained from EGFP C57BL/6 mice) via tail vein (107 cells, 200L). The other groups received saline in the same volume. Pilocarpine-treated animals were monitored for the presence of spontaneous seizures for 21 days (7 prior to cell transplant and 14 afterwards).Forty-five days after transplant rats underwent cognitive evaluation in the object recognition task and the Morris water maze (MWM), followed by the maximal electroshock test to evaluate seizure threshold. Rats were sacrificed seven months after transplantation. The hippocampi, cerebellum, olfactory bulb, and samples of the heart, lung and liver were collected in order to verify the presence of EGFP using PCR. Our results demonstrate that pilocarpine-treated rats injected with BMMC perform better in the MWM when compared to pilocarpine only. This difference was significant in the first and last training days and during the probe trial, when we evaluated the escape latency, time in target quadrant and number of crossings. In addition, seizure frequency was reduced by BMMC. Despite that, in the object recognition task and in the maximal electroshock test no difference was found between epileptic rats treated with BMMC or saline. Finally, we didn’t detect the presence of EGFP in any of the analyzed samples. During the last years much has been done to study the application of stem cells in several neurodegenerative diseases. This kind of approach can also be valid in the treatment of chronic epilepsy, given these cells have the potential of, whichever the mechanism might be, restore the neuronal micro environment and reestablish neuronal physiological excitability.