Modelo de fecundação in vitro de oócitos bovinos sem zona pelúcida

Abstract

A capacitação (CA) e a reação acrossômica (RA) são fenômenos espermáticos essenciais para a fecundação do oócito em mamíferos, e podem ser reproduzidos in vitro. Este estudo teve como objetivo avaliar as taxas de fecundação in vitro (FIV) de oócitos bovinos com e sem zona pelúcida (ZP) utilizando espermatozoides bovinos após a indução da CA e RA in vitro, como modelo para aplicação em outras espécies mamíferas. Para tanto, complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro (MIV) por 24 h, e após 18 h, um grupo de CCOs foi desnudado e oócitos maturos foram submetidos à remoção enzimática da ZP, enquanto outro grupo foi ativado partenogeneticamente com uso de ionomicina. Sêmen bovino foi descongelado a 37°C por 50 s e centrifugado em gradiente de Mini-Percoll. Os espermatozoides foram capacitados em meio sem ou com 10 UI/mL de heparina por 2 h. Após 15 min, uma fração dos espermatozoides foi submetida à indução da RA após exposição a uma solução de cálcio Ionóforo (1 μM) em PBSm. As taxas de CA e RA, e a viabilidade espermática (VE) foram avaliadas pelas colorações de clortetraciclina, e de azul de Tripano e Giemsa, respectivamente. A FIV foi realizada após 24 h de MIV com espermatozoides capacitados (oócitos com ZP, grupo FIV) ou reagidos (oócitos sem ZP, grupo FIV ZF). Após 18 h de FIV ou ativação, todas as estruturas foram coradas com bisbenzimida (15 μg/mL) para avaliação da configuração da cromatina. As taxas de CA, RA e de VE foram de 43%, 29% e 84%, respectivamente. As taxas de fecundação não diferiram entre os grupos de FIV e FIV ZF, e tais taxas não diferiram da taxa de ativação dos oócitos paternotos, utilizados como controle (40, 44 e 47%, respectivamente). No entanto, as taxas de polispermia foram mais altas entre os oócitos com zona pelúcida em comparação com os oócitos sem zona (12 e 2%, respectivamente, p≥0,05). Parte das estruturas foi colocada em cultivo para avaliação da clivagem, não havendo diferença entre os grupos FIV e FIV ZF (53 e 64%, respectivamente). Concluímos que o modelo de oócitos bovinos sem ZP permite a FIV monospérmica, com baixa taxa de polispermia, ainda necessitando de ajustes no protocolo. Como perspectiva, este modelo deverá ser utilizado no futuro para a FIV interespécies, como para a espécie equina.

Sperm capacitation (SC) and acrosome reaction (AR) are essential processes for oocyte fertilization in mammals, a procedure also attainable in vitro. This study aimed to assess in vitro fertilization (IVF) rates of zona pellucida (ZP) intact and zona-free bovine oocytes using bull sperm cells after in vitro SP and AR induction, for use as a model for application in other mammalian species. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COCs) were in vitro-matured (IVM) for 24 h, a group of matured COCs were denuded and subjected to ZP removal by protease after 18 h in IVM. Bovine frozen semen was thawed at 37°C for 50 s and centrifuged through a Mini-Percoll gradient. Sperm cells were incubated in medium without or with 10 IU/mL of heparin for 2 h. After 15 min, a fraction of sperm cells was acrosome reacted with calcium ionophore (1 μM). SC and AR rates, and sperm viability (SV) were evaluated by chlortetracycline (CTC) and Trypan blue with Giemsa stains, respectively. IVF was performed after 24 h of IVM with capacitated (oocytes ZP intact, IVF group) or reacted (zona-free oocytes, IVF-ZF group) sperm cells, while another matured COCs group was activated parthenogenetically using ionomycin (5 μM). All structures were stained using bisbenzimide (15 μg/mL) to assess the chromatin configuration 18 hpf. The SC, AR and SV rates were 43%, 29% and 84%, respectively. No differences in fertilization rates were detected between IVF and IVF-ZF groups and the activation rate (40, 44 and 47%, respectively). However, polyspermy rates were higher in ZP intact oocytes compared to zona-free oocytes (12 and 2%, respectively, p≥0,05). Furthermore, cleavage rates after 24 h of in vitro culture (IVC) did not differ between IFV and IVF-ZF groups (53 and 64%, respectively). In conclusion, the bovine zone-free oocyte model allowed similar monospermic IVF rates to controls, with a low rate of polyspermy. Nevertheless, the protocol still requires development and adjustments. As a perspective, this model should be used in the future for interspecies IVF, such as for the equine species.