Caracterização da atividade sinalizadora da glutationa peroxidase-like 8 (GPHL8) de Arabidopsis thaliana

Abstract

As glutationa peroxidases (GPXs) são enzimas antioxidantes que catalisam a redução de peróxido de hidrogênio (H2O2) ou peróxidos orgânicos em água ou álcoois, usando glutationa (GSH) ou tiorredoxinas (TRXs) como agentes redutores. A grande diversidade entre as GPXs de animais e não animais, em relação à sua estrutura, função, presença do resíduo de selenocisteína (SeCys) e preferência por agentes redutores levanta a questão se elas compartilham um ancestral comum. Como as GPXs de plantas e leveduras usam TRXs como redutores, elas foram denominadas GPX-like (GPXL). Além de interagir com seu substrato usual, sabe-se que GPXL também podem interagir com outras proteínas. É o caso da GPXL3 de levedura (conhecida também como Orp1), a qual oxida o fator de transcrição Yap1 quando na presença de H2O2. Este processo leva à expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na defesa antioxidante, indicando que as GPXLs podem ter outras funções além da redução de peróxidos. A GPXL8 de Arabidopsis thaliana está localizada no citosol e no núcleo. Embora seu papel na destoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) tenha sido descrito anteriormente, pouco se sabe sobre seu envolvimento na detecção e sinalização de ROS. Portanto, nossos principais objetivos neste trabalho foram identificar proteínas que interagem com GPXL8, determinar como e se GPXL8 oxida tais proteínas e desvendar a relação filogenética entre GPXs de animais e não animais. Análises filogenéticas e de sequência indicam que GPXs de animais e não animais compartilham ancestralidade genética, e que a incorporação de SeCys aconteceu no início da evolução do reino animal. Para avaliar a capacidade da GPXL8 de transferir elétrons provenientes do H2O2 e, assim, oxidar proteínas-alvo, usamos uma proteína fluorescente verde sensível à oxirredução (roGFP2) como uma proteína-alvo artificial para GPXL8. Ensaios in vitro mostram que GPXL8 pode oxidar roGFP2, apontando que ela possui atividade de tiol oxidase. Além disso, todas as três cisteínas de GPXL8 regulam e limitam a oxidação de roGFP2. Potenciais proteínas interatoras de GPXL8 foram identificadas pelo método TurboID. Além disso, plantas transgênicas foram geradas para posteriores análises funcionais e fisiológicas. Nossos resultados sugerem que a GPXL8 pode ser uma proteína sensora de alterações redox, e ajudam no entendimento de como as plantas transmitem informações a partir do H2O2 para as proteínas-alvo em resposta a vários estímulos ambientais.

Glutathione peroxidases (GPXs) are antioxidant enzymes that catalyze the reduction of hydrogen peroxide (H2O2) or organic peroxides to water or alcohols, using either glutathione (GSH) or thioredoxins (TRXs) as reducing agents. The large diversity among animal and non-animal GPXs, regarding their structure, function, presence of a selenocysteine (SeCys) residue, and reducing agent preference raises the question of whether they share a common ancestor. Because plant and yeast GPXs use TRXs as reductants, they were termed GPX-like (GPXL). Besides interacting with its usual substrate, GPXL can interact with other proteins. This is the case of yeast GPXL3 (also known as Orp1) that oxidizes the transcription factor Yap1 in the presence of H2O2. This process leads to the expression of genes encoding proteins involved in antioxidative defense. This suggests that GPXLs may have other functions besides peroxide reduction. Arabidopsis thaliana GPXL8 is localized in the cytosol and nucleus. Although its role in reactive oxygen species (ROS) detoxification has been described previously, little is known about its involvement in ROS sensing and signaling. Therefore, our main goals in this study were to identify proteins interacting with GPXL8, determine whether and how GPXL8 oxidizes such proteins, and unveil the phylogenetic relationship between animal and non-animal GPXs. Phylogenetic and sequence analyses indicate that animal and non-animal GPXs share genetic ancestry, and the incorporation of SeCys happened early in the evolution of the animal kingdom. To evaluate the ability of GPXL8 to sense H2O2 and oxidize target proteins, we used a reduction-oxidation-sensitive GFP (roGFP2) as an artificial GPXL8 target protein. In vitro assays display that GPXL8 can oxidize roGFP2, showing that it possesses a thiol oxidase activity. Moreover, all three GPXL8 cysteines regulate and limit the oxidation of roGFP2. GPXL8 putative interacting proteins were identified by the TurboID method. Besides, transgenic plants were generated for further functional and physiological analyses. Our results suggest that GPXL8 can be a redox sensor and help in understanding how plants relay information from H2O2 to target proteins in response to various environmental stimuli.