Desenvolvimento de long-range PCR para amplificação de genomas completos de herpesvírus bovinos tipos 1 e 5

Abstract

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes agentes infecciosos que afetam os bovinos, causando infecções respiratórias, reprodutivas e neurológicas. A disponibilidade de sequências genômicas desses vírus é de particular importância para um melhor entendimento de suas relações com a espécie hospedeira, do perfil das variantes que circulam nos rebanhos brasileiros e sua relevância na epidemiologia dessas infecções. Até o momento, entretanto, nenhum genoma completo do BoHV-1 brasileiro está disponível, enquanto apenas três genomas completos do BoHV-5 (todos brasileiros) foram sequenciados. Isso se deve essencialmente ao fato de que esses herpesvírus têm genomas relativamente longos, com cerca de 130-140 pares de quilobases. O sequenciamento desses genomas longos geralmente envolve a extração de DNA de grandes volumes de suspensões virais, o que é demorado, trabalhoso e caro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma estratégia de sequenciamento de genomas de herpesvírus baseada na amplificação de segmentos de 5 a 10 kb ao longo do genoma viral. Tal conjunto de reações de PCR de longo alcance (“long-range” PCR; LR-PCR), pode fornecer DNA viral suficiente para permitir o sequenciamento integral de BoHV-1 e BoHV-5 sem a necessidade de grandes volumes de suspensões virais. O DNA foi extraído de 200 μl de um estoque de trabalho de BoHV-1 (amostra SV609/03) e BoHV-5 (amostra EVI88/95) multiplicados em linhagem celular de rim bovino (CRIB). As amplificações foram realizadas em reações separadas com cada par de primers, utilizando uma enzima de alta especificidade e processividade. Os produtos obtidos foram submetidos a sequenciamento de alto desempenho na plataforma Illumina Miseq. Foram obtidas 4.011.984 (BoHV-1) e 3.877.550 (BoHV-5) reads, respectivamente. As montagens do genoma foram feitas usando o software Geneious, a partir das sequências de referência MG407776 (BoHV-1) e KY549446 (BoHV-5). O genoma do SV609/03 (BoHV-1) contém 135.099 pb com 72% de GC, apresentando 69 ORFs. O genoma EVI88/95 (BoHV-5) contém 137.654 pb com 74,7% de GC, com 73 ORFs. Na análise de restrição in silico para subtipagem, a amostra de SV609/03 apresentou o mesmo padrão do subtipo 1 (BoHV-1.1) e na amostra de EVI88/95 foi identificado um novo padrão de clivagem, não correspondendo a nenhum subtipo de BoHV-5 proposto até o momento. A subtipagem foi confirmada por análise filogenética.

Bovine Herpesvirus types 1(BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important infectious agents that affect cattle, causing respiratory, reproductive and neurological infections. The availability of genomic sequences of these viruses is of particular importance for a better understanding of their relationships with the host species, the profile of variants circulating in Brazilian herds and its relevance in the epidemiology of such infections. To date, however, no complete genome of Brazilian BoHV-1 is available, whereas only three complete BoHV-5 genomes (all autochthonous to Brazil) have been sequenced. This is essentially due to the fact that these herpesviruses have relatively long genomes, with 130-140 kilobase pairs. Sequencing of such long genomes usually involves extraction of DNA from very large volumes of viral suspensions, which is time consuming, labor intensive and costly. The objective of this work was to develop a strategy for sequencing of herpesvirus genomes based on the amplification of 5 to 10 kb segments along the viral genome. Such set of long-range PCR reactions (LR-PCR), would provide enough viral DNA to allow integral sequencing of BoHV-1 and BoHV-5 without the need for large volumes of viral suspensions. DNA was extracted from 200 μl of a working stock of BoHV-1 (strain SV609/03) and BoHV-5 (strain EVI88/95) multiplied in a bovine kidney cell lineage (CRIB). Amplifications were performed in separate reactions with each pair of primers, using an enzyme of high specificity and processivity. The products obtained were submitted to high performance sequencing using the Illumina Miseq platform. 4,011,984 (BoHV-1) and 3,877,550 (BoHV-5) reads were obtained. Genome assemblies were made using Geneious Software, from the reference sequences MG407776 (BoHV-1) and KY549446 (BoHV-5). The SV609/03 (BoHV-1) genome contains 135,099 bp with 72% of GC, presenting 69 ORFs. The EVI88/95 (BoHV-5) genome contains 137,654 bp with 74.7% of GC, with 73 ORFs. In the in silico restriction analysis for subtyping, the SV609/03 sample showed the same pattern as subtype 1 (BoHV-1.1) and in the EVI88/95 sample, a new cleavage pattern was identified, not corresponding to any BoHV-5 subtype proposed so far. Subtyping was confirmed by phylogenetic analysis.