CRISPR como ferramenta para edição gênica em Cryptococcus gattii

Abstract

Fungos do gênero Cryptococcus, como Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, são geralmente considerados patógenos oportunistas, principais causadores de meningoencefalite em humanos. A doença, conhecida como criptococose, tem como via principal de aquisição a inalação de leveduras dessecadas ou esporos encontrados no ambiente ou em excretas de aves, tendo como alvo primário da infecção o trato respiratório. Devido ao elevado número de casos que evoluem para óbito associados a esta doença, que teve seu auge influenciado pela epidemia de HIV/AIDS, muitos estudos foram desenvolvidos com a finalidade de compreender os mecanismos envolvidos na patogenicidade destes microrganismos e descobrir novos alvos terapêuticos para esta enfermidade. O estudo de genes e caracterização de determinantes de virulência é desenvolvido por meio de técnicas como construção de mutantes nulos e complementação gênica. Com o intuito de gerar a complementação de mutantes nulos se faz necessária a busca por métodos eficientes de edição gênica, para que se evite a integração ectópica que seria um grande entrave na análise da influência dos genes no fenótipo da doença. Sendo assim, a utilização de um sistema que gera uma quebra dupla guiada em um local específico do DNA, permite aumentar as chances de correta integração de um gene exógeno no material genético do organismo alvo de estudos. Baseado no sistema imune adaptativo de procariotos, o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) é amplamente utilizado na geração de mutações genéticas. Para a utilização desse sistema foi realizada a construção de seus componentes principais, um cassete de expressão de uma marca de seleção como DNA doador, um cassete de expressão transitória do RNA guia (gRNA) e um cassete de expressão da enzima endonuclease Cas9, para que pudéssemos transformar as células fúngicas. Foram realizadas a construção dos componentes necessários e a transformação das células de C. gattii através de biolística, embora não alcançadas colônias transformantes, foi possível reproduzir de forma rápida e eficiente a construção dos componentes essenciais para a utilização do sistema CRISPR.

Fungi of the Cryptococcus genus, such as Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, are generally considered opportunistic pathogens that can cause brain infections in humans. This disease, known as cryptococcosis, is primarily acquired through inhaling dried yeast or spores found in the environment or bird excreta, with the respiratory tract being the first site of infection. Due to the high mortality rate associated with this disease, particularly during the HIV/AIDS epidemic, numerous studies have been performed to understand the mechanisms of pathogenicity in these microorganisms and identify new therapeutic targets. The study of genes and virulence factors is generally done by constructing null mutants and introducing the wild-type gene back into them (gene complementation). To successfully perform complementation, efficient gene editing methods are crucial to avoid ectopic integration, which can hinder analysis of the gene's role in the disease phenotype. Therefore, using a system that creates a targeted double-strand break in the DNA increases the chances of correctly integrating the exogenous gene into the target organism's genome. The CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) system is a popular tool for generating genetic mutations. To utilize this system, we constructed its key components: an expression cassette for a selection marker as donor DNA, a transient expression cassette for the guide RNA (gRNA), and an expression cassette for the Cas9 endonuclease enzyme. We then transformed C. gattii cells using the biolistics protocol, although we did not obtain transformed colonies. Nevertheless, this process allowed us to efficiently reproduce the construction of the essential components for future CRISPR experiments.