Avaliação da segurança e eficácia da administração de vetores do sistema CRISPR/Cas9 para tratamento dos sintomas articulares da mucopolissacaridose tipo I

Abstract

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal causada por mutações no gene IDUA que codifica a proteína alfa-L-iduronidase (IDUA), responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) sulfato de dermatano e sulfato de heparano no interior dos lisossomos. A MPS I impacta no funcionamento dos sistemas respiratório, cardíaco, neurológico e em componentes do sistema sensorial como audição e visão. As disfunções articulares surgem na grande maioria dos acometidos com MPS I e geralmente precedem o diagnóstico. O acúmulo de GAGs estimula o recrutamento de células inflamatórias para o interior do ambiente articular, as quais secretam citocinas inflamatórias e contribuem para o enrijecimento e dor. A matriz cartilaginosa densa e avascular da articulação dificulta a penetração de fármacos em seu interior, o que é um desafio para a terapia de reposição enzimática, tratamento convencional atualmente utilizado em pacientes com MPS I. Levando em consideração esse obstáculo, o presente estudo se propôs a desenvolver e avaliar a segurança e eficácia da administração intra-articular de dois plasmídeos - um doador do gene Idua e um plasmídeo codificante da proteína Cas9 - adsorvidos a uma nanoemulsão catiônica carreadora de um anti-inflamatório esteroidal em camundongos modelo de MPS I. Inicialmente, testamos o efeito do tratamento na viabilidade mitocondrial de fibroblastos semelhantes a sinoviócitos extraídos de joelho de camundongos MPS I . O potencial irritante dos complexos nanoemulsionados também foi avaliado em membrana cório-alantoide de ovo de galinha no teste HET-CAM. A formulação não se mostrou citotóxica ou irritante nos testes in vitro. Nos ensaios in vivo, a administração dos complexos pela via intra-articular em camundongos MPS I revelou que animais que receberam o tratamento demonstraram menores níveis de citocinas inflamatórias (IL-6) e tiveram aumento significativo da atividade de IDUA em líquido sinovial. Em suma, o tratamento desenvolvido se mostrou seguro, não gerou inflamação local e apresentou alta retenção no interior da cápsula articular, além de ser eficaz no aumento da atividade da enzima IDUA na cavidade articular de camundongos MPS I após edição gênica in situ. Como perspectivas faz-se necessário avaliar o efeito do tratamento em um maior período pós-administração, além de observar se, de fato, há diminuição do acúmulo de GAGs e melhora nos sintomas osteoarticulares. Ainda assim, o produto desenvolvido possui potencial no tratamento in situ dos sintomas articulares da MPS I.

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal disease caused by mutations in the IDUA gene that encodes the protein alpha-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan sulfate and heparan sulfate within lysosomes. . MPS I impacts the functioning of the respiratory, cardiac, neurological systems and components of the sensory system such as hearing and vision. Joint dysfunctions appear in the vast majority of those affected with MPS I and generally precede the diagnosis. The accumulation of GAGs stimulates the recruitment of inflammatory cells into the joint environment, which secrete inflammatory cytokines and contribute to stiffness and pain. The dense and avascular cartilaginous matrix of the joint makes it difficult for drugs to penetrate its interior, which is a challenge for enzyme replacement therapy, a conventional treatment currently used in patients with MPS I. Taking this obstacle into account, the present study proposed to develop and evaluate the safety and efficacy of intra-articular administration of two plasmids - a donor of the Idua gene and a plasmid encoding the Cas9 protein - adsorbed to a cationic nanoemulsion carrying a steroidal anti-inflammatory drug in MPS I model mice. Initially, we tested the effect of treatment on the mitochondrial viability of synoviocyte-like fibroblasts extracted from the knees of MPS I mice. The irritating potential of nanoemulsified complexes was also evaluated in chicken egg chorio-allantoic membrane in the HET-CAM test. The formulation did not prove to be cytotoxic or irritating in in vitro tests. In in vivo tests, administration of the complexes intra-articularly in MPS I mice revealed that animals that received the treatment demonstrated lower levels of inflammatory cytokines (IL-6) and had a significant increase in IDUA activity in synovial fluid. In short, the developed treatment proved to be safe, did not generate local inflammation and showed high retention within the joint capsule, in addition to being effective in increasing the activity of the IDUA enzyme in the joint cavity of MPS I mice after in situ gene editing. As perspectives, it is necessary to evaluate the effect of the treatment in a longer post-administration period, in addition to observing whether, in fact, there is a reduction in the accumulation of GAGs and an improvement in osteoarticular symptoms. Even so, the developed product has potential in the in situ treatment of MPS I joint symptoms.