Acidez tumoral aumenta agressividade, migração celular, resistência ao tratamento no carcinoma espinocelular oral e altera a resposta imunológica antitumoral

Abstract

A presença de lactato e acidificação extracelular são características marcantes do microambiente de tumores sólidos, que decorrem de alterações no metabolismo celular. O pH de tumores de cabeça e pescoço é ácido, variando entre 6.2 e 6.9. Tais condições observadas no microambiente tumoral são correlacionadas na literatura à maior agressividade, disseminação e resistência ao tratamento, bem como ao comprometimento de diversas funções efetoras do sistema imune. Há indicativos de que a capacidade adquirida pelas células tumorais em alterar seu metabolismo energético regulando a secreção de ácido lático e a resultante acidificação do meio extracelular, compõem o grupo de estratégias que culminam no mecanismo de evasão das células tumorais à ação antitumoral do sistema imune. Considerando que o papel do lactato/acidez tumoral no carcinoma espinocelular oral segue pouco explorado, com o primeiro artigo da presente tese, avaliamos in vitro o comportamento de células de carcinoma espinocelular oral (SCC4 e SCC25) expostas à acidez extracelular. Foram analisadas migração, indiferenciação e resistência ao tratamento quimio e radioterápico das linhagens supracitadas cultivadas em diferentes esquemas experimentais, os quais consistiram em três grupos principais: Exposição contínua ao meio de cultura neutro (pH 7.4), considerado o controle e denominado pH 7.4; Exposição contínua ao meio de cultura celular acidificado (pH 6.8) por um período de 7 dias, foi denominado pH 6.8; Exposição intermitente, inicialmente cultivadas em meio de cultura acidificado (pH 6.8) durante 7 dias, seguidos de mais 7 dias de cultivo em meio neutro (pH 7.4), denominado pH 6.8 → pH 7.4, na tentativa de mimetizar as flutuações de pH observadas no microambiente tumoral. Além desses, um grupo mimetizando a acidez de forma crônica, induzida pela exposição das células ao meio de cultura acidificado (pH 6.8) por um período de 21 dias, denominado pH 6.8, foi estabelecido para confirmação de alguns achados. Após exposição à acidez, as células adquiriram um fenótipo fusiforme, achado confirmado por meio da análise da razão de polaridade. A análise de viabilidade celular indicou, para ambas as linhagens celulares, uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,0001) do potencial de sobrevivência após exposição ao pH 6.8, o qual foi em parte recuperado após recondicionamento das células em pH 7.4. Observou-se uma redução significativa da expressão de E-Caderina acompanhada de um aumento da expressão dos marcadores de EMT NCaderina e Vimentina nos grupos teste (p<0,05). O aumento da capacidade migratória do grupo pH 6.8 → pH 7.4 (SCC4) foi observado por meio dos ensaios de cicatrização de ferida (p<0,0001), capacidade invasiva em transwell (p=0,022) e potencial de motilidade (p<0,05) em ensaio de time-lapse. Observou-se um aumento da expressão dos marcadores de pluripotência CD44 e NANOG (p<0,05) no grupo de pH 6.8. Com relação aos tratamentos quimio e radioterápicos, as células tumorais demonstraram maior resistência à Cisplatina (p<0,05) e à radiação (p<0,0001) durante a exposição à acidez extracelular. Para melhor compreensão dos efeitos do lactato e da acidez presentes no microambiente tumoral sobre a resposta imunológica, desenvolvemos uma revisão de escopo sistemática da literatura. Foram incluídos 96 estudos os quais apontaram uma correlação entre acidez extracelular e presença de lactato no microambiente tumoral e comprometimento de diversas funções celulares de imunócitos.

The presence of lactate and extracellular acidification are solid tumors’ microenvironment hallmarks happening as a consequence of alterations in cellular metabolism. The pH of head and neck tumors is makedly low varying between 6.2 and 6.9. These conditions observed in the tumor microenvironment (TME) have been correlated in the literature with increased aggressiveness, dissemination and resistance to treatment, and impaired immune functions. There are evidence indiating that the capacity acquired by tumor cells to alter their energy metabolism by regulating the secretion of lactic acid and the resulting acidification of the extracellular milieu build the group of strategies culminating in neoplastic cells’ evasion from antitumor actions of the immune system. Considering that the role of lactate/tumor acidity in oral squamous cell carcinoma remains little explored, in the first article of this thesis, we evaluated the behavior of human oral squamous cell carcinoma cells (SCC4 and SCC25) exposed to extracellular acidity in vitro. Migration, undifferentiation, and resistance to chemoand radiotherapy treatment of the strains mentioned above cultured in different experimental schemes were analyzed. Attempting to mimic the pH fluctuations observed in the TME, three main groups were established: Continuous exposure to neutral culture medium (pH 7.4), considered the control and named pH 7.4; Continuous exposure to acidified cell culture medium (pH 6.8) for a period of 7 days, was named pH 6.8; Intermittent exposure, initially cultured in acidified culture medium (pH 6.8) for 7 days, followed by another 7 days of culture in neutral medium (pH 7.4), named pH 6.8 → pH 7.4. Furthermore, acidity in a chronic manner, induced by exposing a group of cells to acidified cell culture medium (pH 6.8) for a period of 21 days, termed pH 6.8, was established in order to confirm some findings. After exposure to acidity, the cells acquired a fusiform phenotype, a finding that was confirmed by polarity ratio analysis. Cell viability analysis indicated, for both cell lines, a statistically significant (p<0.0001) decrease in survival potential after exposure to pH 6.8, which was partially recovered after reconditioning cells at pH 7.4. We observed a significant reduction of E-Cadherin expression accompanied by an increased expression of the EMT markers N-Cadherin and Vimentin in the test groups (p<0.05). The increased migratory capacity of the pH 6.8 → pH 7.4 (SCC4) group was observed via wound healing assays (p<0.0001), transwell invasive capacity (p=0.022), and motility potential (p<0.05) in time-lapse assays. Increased expression of pluripotency markers CD44 and NANOG (p<0.05) was observed for the pH 6.8 group. Regarding chemo- and radiotherapy treatments, tumor cells showed increased resistance to Cisplatin (p<0.05) and radiation (p<0.0001) during exposure to extracellular acidity. To better understand the effects of lactate and acidity present in the tumor microenvironment on the immune response, we developed a systematic scoping review of the literature. Ninety-six studies were included and a correlation between extracellular acidity/lactate abundance at the tumor microenvironment and impairment of various immunocyte cellular functions were observed.