Microbiota e perfil de resistência a antimicrobianos em carcaças congeladas de frango de produção convencional e certificadas como de criação com restrição de uso de antimicrobianos

Abstract

O aumento e disseminação de bactérias resistentes a antimicrobianos é considerado um problema global de saúde pública. Entre as causas desse problema são frequentemente citados o uso indiscriminado de antimicrobianos em humanos, animais de produção e agricultura. Estudos têm demonstrado os animais de produção como importantes reservatórios de bactérias resistentes a antimicrobianos devido à pressão de seleção exercida pelo uso de antibióticos durante sua criação. Os alimentos de origem animal podem servir de veículo para micro-organismos patogênicos resistentes a antimicrobianos, ou mesmo para bactérias comensais portadoras de genes de resistência, os quais podem ser transmitidos para a microbiota de humanos. As soluções propostas para esse problema vão desde o banimento do uso de antimicrobianos importantes para a saúde humana com a finalidade de aditivos zootécnicos em animais até a mudança para sistemas de criação alternativos como as produções orgânica e livre de antibióticos. O impacto dessas medidas em animais de criação intensiva como o frango ainda está sendo avaliado, bem como as possíveis diferenças em termos da presença de marcadores fenotípicos e genotípicos de resistência a antimicrobianos nos produtos originados de sistemas alternativos. Sendo assim, o presente estudo objetivou comparar grupos de carcaças congeladas de frango com selo de produção orgânica (GO) ou livre de antibióticos (GL) em relação àqueles de produção convencional (GC), nos seguintes aspectos: i) diferença de padrões de resistência a antimicrobianos em Escherichia coli genérica isoladas a partir das carcaças; ii) presença de bactérias produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL); e iii) diferença da microbiota e dos perfis de genes de resistência a antimicrobianos presentes nas carcaças. Para tanto, 24 frangos congelados embalados na indústria pertencentes a cada um dos três grupos foram adquiridos no comércio varejista, descongelados e submetidos individualmente à lavagem com água peptonada. Para avaliação do perfil fenotípico de resistência, 216 cepas de E. coli isoladas do líquido de lavagem foram avaliadas frente à 12 antimicrobianos. A pesquisa de E. coli-ESBL foi realizada por isolamento seletivo a partir do líquido de lavagem, de acordo com o protocolo elaborado pela European Union Reference Laboratory Antimicrobial Resistance, seguido da avaliação do perfil fenotípico de resistência a 19 antimicrobianos nas cepas confirmadas como produtoras de ESBL. Um total de 24 cepas de E. coli produtoras de ESBL foram escolhidas, submetidas a sequenciamento completo do genoma e avaliadas in silico quanto à filogenia e a presença de genes de resistência a antimicrobianos. A caracterização da microbiota bacteriana e do metarresistoma foram realizadas por metagenômica shotgun, a partir do sequenciamento de alto desempenho do DNA total dos produtos de lavagem das carcaças. A resistência a pelo menos um antimicrobiano foi observada em 59,2% (128/216) do total das cepas de E. coli independente do grupo. As maiores frequências de resistência foram à tetraciclina (TET; 32,4%), trimetoprima (TRI; 28,2%), ampicilina (AMP; 25,0%) e ácido nalidíxico (NAL; 18,5%). Não foram detectadas cepas resistentes à colistina, meropenem e tigeciclina. Os valores de MIC50 ficaram abaixo do ponto de corte clínico (CLSI, 2020) e do ponto de corte epidemiológico (ECOFF) nos três grupos de amostras. Em relação aos valores de MIC90, NAL, AMP e TET apresentaram valores acima do ponto de corte clínico e epidemiológico independente do grupo. Além disso, o grupo GO apresentou MIC90 acima do ponto de corte clínico para gentamicina e GL ultrapassou este ponto de corte para gentamicina e cefotaxima. A partir do modelo de regressão de Poisson verificou-se que, tomando GC como referência, houve diferença no sentido de maior ocorrência de cepas de E. coli totalmente suscetíveis, menor frequência de multirresistência, e menor número de cepas resistentes à ampicilina e ácido nalidíxico em GO. Em GL, apenas a menor frequência de resistentes à ampicilina em relação a GC foi demonstrada. Escherichia coli-ESBL foi encontrada em 39% dos frangos analisados. Oito carcaças apresentaram o perfil fenotípico ESBL/AmpC, representando 23,2% (17/73) das cepas ESBL. As maiores frequências de resistência em E. coli-ESBL foram detectadas frente a ácido nalidíxico, ceftiofur, cefepime, sulfametoxazol+trimetoprim e tetraciclina. A frequência de E. coli-ESBL multirresistente foi de 76,7%. Todos os isolados foram suscetíveis à meropenem, amicacina, nitrofurantoína e colistina. O resistoma das cepas E. coli-ESBL sequenciadas identificou a presença de 95 genes de resistência distintos. Dentre os genes que conferem resistência aos betalactâmicos, foram identificados genes codificadores de enzimas do tipo AmpC (blaCMY-2) e ESBL (blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCTX-M-55, blaSHV-2A e blaTEM-141-1). Foram identificados 18 Tipos de Sequência (ST) e 15 sorotipos distintos nessas cepas, dentre eles ST131 e ST648, os quais são importantes patógenos para humanos. Quanto à caracterização da microbiota das amostras, não houve diferença entre os grupos em relação a abundância dos principais filos e classes presentes. O principal filo identificado foi Proteobacteria, enquanto as famílias Pseudomonadaceae, Moraxellaceae e Enterobacteriaceae foram as mais frequentes. As análises do metarresistoma demonstraram maior abundância de genes de resistência em GC. Os genes mais frequentemente identificados codificam resistência a betalactâmicos e aminoglicosídeos. Vinte e nove genes foram comuns aos três grupos, incluindo os genes que conferem resistência a betalactâmicos, aminoglicosídeos e tetraciclinas, além de genes de bombas de efluxo que podem conferir resistência a mais de uma categoria de antimicrobianos. Conclui-se que frangos congelados com selo de produção orgânica e livre de antibióticos apresentam perfis de genes de resistência, microbiota, presença de E. coli produtora de ESBL e prevalência de resistência fenotípica a antimicrobianos semelhantes ao encontrado em frangos de criação convencional. Entretanto, frangos com selo de produção orgânica apresentam maior prevalência de E. coli genérica totalmente suscetível a antimicrobianos importantes para humanos, menor prevalência de cepas multirresistentes e menor frequência de cepas resistentes à ampicilina e ácido nalidíxico do que frangos de produção convencional. De forma similar, a abundância de genes de resistência presentes em frangos congelados de produção orgânica é menor do que a encontrada em frangos de produção convencional. Essas observações indicam que há menor pressão de seleção de resistência a antimicrobianos nos sistemas de produção orgânica e que esse fato tem reflexo no produto ofertado ao consumidor.

The increase and dissemination of antimicrobial resistant bacteria is considered a global public health problem. Among their causes the indiscriminate use of antimicrobials in humans, animal production and agriculture are often cited. Studies have pointed out food-animals as important reservoirs of bacteria resistant to antimicrobials caused by the selection pressure exerted by the use of antibiotics during their rearing. Meat and other foods of animal origin, in turn, can be a vehicle for pathogenic or commensal microorganisms that, in this way, can reach the consumer, disseminating resistance genes in the human microbiota. The proposed solutions to this problem can range from banning the use of antimicrobials important for human health in animals, to the adoption of alternative farming systems such as organic production. The impact of these measures on intensive reared livestock, such as poultry, as well as the differences in terms of the presence of phenotypic and genotypic markers of antimicrobial resistance in products originating from alternative systems have been studied. Thus, the present study aimed at comparing groups of frozen chicken carcasses certificated as from organic production (GO) or antibiotic-free production (GL) with those of conventional production (GC), in the following aspects: i) difference in antimicrobial resistance patterns of generic E. coli isolated from carcasses; ii) presence of extended-spectrum β-lactamase producing bacteria (ESBL); and iii) difference in the microbiota and profiles of antimicrobial resistance genes present in the carcasses. For this purpose, 24 frozen chicken packaged in the industry belonging to each of the three groups were purchased in supermarkets, thawed and subjected to individual peptone water rinsing. For the determination of the phenotypic resistance profile of E. coli, 216 strains isolated from the rinsing liquid were evaluated against 12 antimicrobials according to CLSI/2020 and EUCAST. The E. coli-ESBL survey was carried out by selective isolation, according to the protocol elaborated by the European Union Reference Laboratory Antimicrobial Resistance, followed by the evaluation of the phenotypic resistance profile to 19 antimicrobials in the strains confirmed as ESB-producers. A total of 23 strains of ESBL-producer E. coli were chosen, subjected to genomic sequencing and analyzed for the presence of antimicrobial resistance genes and phylogenetics. The characterization of the bacterial microbiota and the metarresistoma were carried out by sequencing the DNA obtained from pooled rinse-fluids of carcasses from each group, using the shotgun approach. Resistance to at least one antimicrobial was observed in 59.2% (128/216) of E. coli strains regardless of the group. The highest frequencies of resistant strains were reported to tetracycline (TET; 32.4%), trimethoprim (TRI; 28.2%), ampicillin (AMP; 25.0%) and nalidixic acid (NAL; 18.5%). Strains resistant to colistin, meropenem and tigecycline were not detected. The MIC50 was below both the clinical cutoff point (CLSI, 2020) and the epidemiological cutoff point (ECOFF) in E. coli strains belonging to the three sample groups. Regarding the MIC90, NAL, AMP and TET presented values above the clinical and epidemiological cutoff point regardless of the group. In addition, the GO group presented MIC90 above the clinical cutoff point for gentamicin and GL exceeded this cutoff point for gentamicin and cefotaxime (GL). The Poisson regression model, using GC as the reference, showed a higher frequency fully susceptible, and lower frequency of multidrug resistance, and fewer strains resistant to ampicillin and nalidixic acid. in E. coli strains from GO. In GL, only the lowest frequency of ampicillin resistant compared to GC was demonstrated. ESBL-producer E. coli was found in 39% of the chickens analyzed. Eight carcasses showed the ESBL/pAmpC phenotypic profile, accounting for 23.2% (17/73) of the ESBL-producer strains. The highest frequencies of resistance in E. coli-ESBL were detected against nalidixic acid, ceftiofur, cefepime, sulfamethoxazole + trimethoprim and tetracycline. The frequency of multidrug-resistant E. coli-ESBL was 76.7%. All isolates were susceptible to meropenem, amikacin, nitrofurantoin and colistin. The resistome of the sequenced E. coli-ESBL strains identified the presence of 95 distinct resistance genes. Among the genes that confer resistance to beta-lactams, genes encoding enzymes of the AmpC-type (blaCMY-2) and ESBL (blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCTX-M-55, blaSHV-2A and blaTEM- 141-1) were found. Eighteen Sequence Types (ST) and 15 distinct serotypes were identified in these strains, among them ST131 and ST648, which are important pathogens for humans. As for the characterization of microbiota, there was no difference between groups regarding the abundance of the main phyla and classes present. The main phylum identified was Proteobacteria, while the families Pseudomonadaceae, Moraxellaceae and Enterobacteriaceae were the most frequent. The analysis of the metarresistoma demonstrated a greater abundance of resistance genes in GC. The most frequently identified genes code for resistance to beta-lactams and aminoglycosides. Twenty-nine genes were common to the three groups, including genes that confer resistance to beta-lactams, aminoglycosides and tetracyclines, as well as efflux pump genes that can confer resistance to more than one category of antimicrobials. It is concluded that frozen chickens with certification of organic production or free of antibiotics have profiles of resistance genes, microbiota, presence of ESBL-producing E. coli and prevalence of phenotypic resistance to antimicrobials similar to that found in conventionally reared chickens. However, chickens certificated as from organic production have a higher prevalence of generic E. coli that is full susceptible to important antimicrobials for humans, less prevalence of multidrug-resistant strains and less frequency of strains resistant to ampicillin and nalidixic acid than conventionally produced chickens. Similarly, the abundance of resistance genes present in frozen organic chickens is lower than that found in conventionally produced chickens. These observations indicate that there may be less pressure to select resistance to antimicrobials in organic production systems and that this fact has impact in the product offered to the consumer.