Avaliação da citotoxicidade e do efeito anti-inflamatório de nanocápsulas contendo nicotina

Abstract

A nanotecnologia é uma área multidisciplinar que combina química, física, biologia e engenharia e tem sido extensivamente utilizada na pesquisa em saúde. Seu objetivo é criar materiais funcionais a partir do controle da matéria na escala nanométrica, produzindo, assim, materiais com novas propriedades químicas, físicas e biológicas. Particularmente na área biomédica, a nanotecnologia é muito utilizada na produção dos sistemas de liberação controlada de fármacos, como é o caso das nanopartículas. Dessa forma, a nanotecnologia é uma importante ferramenta no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para diagnóstico, tratamento ou mesmo regeneração do sistema nervoso central em condições neurológicas como Esclerose Múltipla, Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer e Lesão da Medula Espinal (LME). Sabendo-se que a inflamação é um dos mais importantes eventos presentes após a LME, surge a hipótese de que diminuir o processo inflamatório nessa porção do Sistema Nervoso Central poderia auxiliar na regeneração axonal e na melhora da função motora dos pacientes. Nesse trabalho, o objetivo foi produzir nanocápsulas com o polímero Eudragit contendo nicotina, alcalóide encontrado no tabaco, que possui atividade anti-inflamatória e avaliá-las in vitro em células PC12. As nanocápsulas foram preparadas pelo método de deposição interfacial de polímero pré-formado e foram primeiramente caracterizadas quanto ao seu potencial Zeta, diâmetro de partícula, índice de polidispersão, morfologia, pH, estabilidade ao longo do tempo, eficiência de encapsulamento da nicotina e perfil de liberação controlada. A seguir, foram realizados testes para se verificar a citotoxicidade e o efeito inflamatório das nanocápsulas. Para isso, ensaios de redução de MTT e LIVE/DEAD foram realizados. Também realizou-se o teste de de imunoabsorção enzimática (ELISA), para a detecção da expressão de citocinas, após o tratamento da linhagem celular PC12 com as nanocápsulas em duas concentrações distintas. As nanocápsulas foram caracterizadas e obtiveram valores dentro do esperado para potencial zeta, diâmetro, perfil de liberação controlada e estabilidade ao longo do tempo de armazenamento; no entanto, um baixo valor de eficiência de encapsulamento foi detectado. Nos testes in vitro, de forma geral, observou-se que o tratamento com nanocápsulas reduziu a viabilidade das células comparada ao grupo controle, mesmo aquelas tratadas com nanocápsulas vazias (sem fármaco encapsulado). Isso sugere que o polímero, ou a quantidade de polímero sobre as células, tenha sido prejudicial a elas, uma vez que as mesmas foram capazes de sobreviver após o tratamento com nicotina pura. No ensaio de ELISA, as citocinas IL- 6 e TNF-α apresentaram-se aumentadas nos grupos tratados com as nanocápsulas, corroborando com a hipótese de que as nanocápsulas têm efeito tóxico sobre as células PC12, ao elevar a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Dessa forma, faz- se necessário melhorar a formulação das nanocápsulas, de forma a obter valores de eficiência de encapsulamento satisfatórios. Ainda, argumenta-se que a citotoxicidade e o efeito inflamatório apresentado pelas cápsulas possa ser devido à formação da chamada corona proteica, bem como à própria composição das cápsulas, uma vez que o Eudragit já foi reportado em outros estudos tendo efeitos citotóxicos. Assim, é preciso também estudar melhor as interações das nanocápsulas produzidas em nosso laboratório, de modo a se ter um melhor conhecimento sobre o tipo de interação que se dá entre célula e partícula e seus possíveis efeitos tóxicos.

Nanotechnology is a multidisciplinary field that combines chemistry, physics, biology and engineering and has been extensively used in health research. Its goal is to create functional materials through the control of matter on the nanometer scale, thus producing materials with new chemical, physical and biological properties. nanotechnology is widely used in the production of controlled drug release systems, such as nanoparticles, particularly in the biomedical field. Besides this, nanotechnology is an important tool in the development of new therapeutic strategies for diagnosis, treatment or even regeneration of the central nervous system in neurological conditions such as Multiple Sclerosis, Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Spinal Cord Injury (SCI). With inflammation being one of the most important events present after SCI, the hypothesis arises that stopping the inflammation in this portion of the Central Nervous System would aid in axonal regeneration and improve motor function of patients. In this study, nanocapsules were produced with Eudragit polymer containing nicotine, an alkaloid found in tobacco that has anti-inflammatory activity. The nanocapsules were prepared by the preformed polymer interfacial deposition method and were previously characterized by their Zeta potential, particle diameter, polydispersion index, morphology, pH, stability over time, nicotine encapsulation efficiency, and controlled release profile. Subsequently, in vitro tests were performed to verify the cytotoxicity and inflammatory effect of the nanocapsules. To perform this, MTT assay and LIVE/DEAD assay were carried out, as well as Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) for detection of cytokine expression after treatment of the PC12 cell line with nanocapsules at two distinct concentrations. The nanocapsules obtained the expected values for zeta potential, diameter, controlled release profile and stability over storage time; however, a low encapsulation efficiency value was detected. In the in vitro tests, in general, it was observed that nanocapsule treatment reduced cell viability compared to the control group, even those treated with empty nanocapsules (without encapsulated drug). This suggests that the polymer, or the amount of polymer on top of cells, was detrimental to them as the cells were able to survive after treatment with bulk nicotine. In the ELISA assay, IL-6 and TNF-α cytokines were increased in the nanocapsule-treated groups, corroborating the hypothesis that nanocapsules have toxic effects on PC12 cells by increasing the expression of proinflammatory cytokines. It is therefore necessary to improve nanocapsule formulation in order to obtain satisfactory encapsulation efficiency values. Moreover, it is argued that the cytotoxicity and the inflammatory effect presented by the nanocapsules may be due to the formation of the protein corona, as well as to the composition of the capsules, as Eudragit has already been reported concerning its toxic effects. Therefore, it is necessary to better comprehend the cell-particle interactions, in order to obtain deeper knowledge regarding nanocapsule effects.