Resistance profile and genetic features associated with plasmid-mediated quinolone resistance in Escherichia coli isolates from wastewater and clinical samples

Abstract

Resistance mechanisms mediated by mobile genetic elements are considered the main drivers of the spread of antimicrobial resistance. Wastewater environments are directly connected to the population and hospitals, offering optimal conditions for horizontal gene transfer (HGT). Quinolone resistance genes spread majorly through plasmids (PMQR - Plasmid Mediated Quinolone Resistance), which are reported commonly in Escherichia coli. This study aims to evaluate the susceptibility profile and the genetic context of quinolone resistance in E. coli isolates from wastewaters in Porto Alegre and the metropolitan region, as well as from clinical isolates obtained from the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). 137 Escherichia coli isolates were recovered from wastewater samples, while 65 E. coli isolates were from a hospital (Hospital de Clínicas de Porto Alegre - HCPA) in Porto Alegre, RS, Brazil. Wastewater samples were from 2020, and clinical E. coli isolates were from 2020 and 2021. The mass spectrometry technique confirmed species level identification using the MALDI-TOF Biotyper (Bruker microflex® LT/SH), and the antimicrobial susceptibility profile was determined using a disk diffusion test. The identification of quinolone resistance genes qnrA, qnrB, qnrS, and aac(6’)Ib-cr was performed by in-house PCR for all isolates. The evaluation of ciprofloxacin Minimal Inhibitory Concentration was determined for resistant isolates according to disk-diffusion test and for isolates with one or more quinolone resistance genes. Seven isolates with no temporal epidemiological relatedness that harbored at least one quinolone resistance gene detected were selected for Whole-Genome Sequencing (WGS) performed by Illumina MiSeq (2 x 250 bp paired-end reads). Genomic DNA was extracted using a QIAamp DNA Mini Extraction Kit (QIAGEN®), the concentration was determined by Qubit (Thermo Fisher Scientific), and NanoDrop™ determined the quality. The paired-end library was constructed with the Illumina DNA Library Prep Kit. Raw data were assembled using CLC Genomic Workbench v. 23, and antimicrobial resistance genes were identified using QIAGEN Microbial Insight-Antimicrobial Resistance database (QMI-AR). Multilocus Sequence Typing (MLST), plasmid typing, and Mobile genetic elements were performed using MLST 2.0, PlasmidFinder, and MobileElementFinder 2.1, respectively. Comparative genomic analysis was performed using Geneious Prime 9.0.5. Roary v.3.13.0 and SNP-sites v2.5.1 were used for the phylogenetic analyses using core-genome single nucleotide polymorphisms (cgSNPs). A maximum-likelihood (ML) SNP-based phylogenetic tree was constructed using IQ-TREE v2.3.6, and tree topology, annotation, and analysis were visualized with MEGA v.11.0.13. In total, 21 isolates presented a resistant profile to ciprofloxacin (21/202; 10.3%) and 32 (32/202; 15.8%) isolates were positive for some of the resistance genes investigated. The most frequent PMQR gene was aac(6’)-Ib-cr, found in 13.8% of the isolates (28/202), followed by qnrS (4.9%, 10/202) and qnrB (2.4%, 5/202). The qnrA gene was not detected in any isolate. Among the 32 isolates harboring quinolone resistance genes, only 13 (40.6%) were resistant to ciprofloxacin, of which 7 (21.8%) had MIC ≥ 32 μg/mL, one isolate (3.1%) had MICs of 16 μg/mL, and three isolates (9.3%) had MIC = 8 μg/mL. MLST revealed that all sequenced isolates belonged to different STs, and PlasmidFinder analyses identified 10 plasmid incompatibility groups (Inc) among the sequenced isolates, with IncFII being the most prevalent, found only in isolates of clinical origin (3/7; 42.8%). The qnrS1 gene was identified in an IncR-type plasmid (MSU0060) and the qnrB19 gene in a Col(pHAD28)-type plasmid (MSU0183). Wastewater isolates and clinical isolates did not present plasmids of the same Inc types. Furthermore, phylogenetic analysis based on 3178 core genome SNPs revealed that wastewater E. coli isolates form a separate clade from clinical isolates. Overall, we observed low resistance rates in wastewater E. coli isolates, and we did not observe a clear epidemiological connection with isolates from hospital patients. Furthermore, the plasmids found in E. coli isolates of clinical origin were not the same as those found in those of environmental origin. This may be due to the fact that selective pressure in aquatic environments is significantly lower than in hospital environments; however, to obtain a better picture of the spread of resistance in these environments, plasmid typing of a larger N of isolates is needed. Wastewater-based epidemiology continues to stand out as an important tool for understanding the persistence and spread of resistance patterns, aiding in taking measures and creating strategies to slow the spread of antimicrobial resistance.

Mecanismos de resistência mediados por elementos genéticos móveis são considerados os principais propulsores da disseminação da resistência antimicrobiana. Ambientes de águas residuais estão diretamente conectados à população e a hospitais, oferecendo condições ideais para a transferência horizontal de genes (HGT). Mecanismos plasmidiais de resistência a quinolonas (PMQR - Plasmid Mediated Quinolone Resistance) são facilmente disseminados pela transferência horizontal, além de comumente relatados em Escherichia coli. Este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de susceptibilidade e o contexto genético da resistência a quinolonas em isolados de E. coli obtidos de águas residuais em Porto Alegre e região metropolitana, bem como de isolados clínicos obtidos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Um total de 137 isolados de Escherichia coli foram obtidos de amostras de efluentes, bem como 65 isolados de E. coli de pacientes. As amostras de águas residuais foram coletadas em 2020, e os isolados clínicos de E. coli foram coletados de 2020 a 2021. A identificação a nível de espécie foi confirmada pela técnica de espectrometria de massa usando o MALDI-TOF Biotyper (Bruker microflex® LT/SH), e o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos foi determinado pelo teste de disco-difusão. Os genes de resistência à quinolonas qnrA, qnrB, qnrS e aac(6’)Ib-cr foram pesquisados por PCR in house em todos os isolados. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) de ciprofloxacino foi determinada para os isolados que apresentaram perfil resistente no teste de disco-difusão e/ou isolados com um ou mais genes de resistência à quinolonas. Sete isolados sem relação epidemiológica temporal, que abrigavam um ou mais genes de resistência à quinolonas foram selecionados para o Sequenciamento do Genoma Completo (WGS). O WGS foi realizado pelo Illumina MiSeq (2 x 250 bp leituras pareadas). O DNA genômico foi extraído utilizando o kit de extração QIAamp DNA Mini Extraction Kit (QIAGEN®), a concentração do DNA foi determinada pelo Qubit (Thermo Fisher Scientific) e a qualidade pelo NanoDrop™. A biblioteca de leituras pareadas foi construída utilizando o Illumina DNA Library Prep Kit. Os dados brutos foram montados usando o CLC Genomic Workbench v. 23 e os genes de resistência antimicrobiana foram identificados com o banco de dados QIAGEN Microbial Insight-Antimicrobial Resistance (QMI-AR). A tipagem molecular (MLST) e o grupo de incompatibilidade plasmidial foram determinados usando o MLST 2.0 e o PlasmidFinder 2.1, respectivamente. Os elementos genéticos móveis foram identificados usando o MobileElementFinder (MGE). A análise genômica comparativa foi realizada usando o Geneious Prime 9.0.5. As análises filogenéticas usando polimorfismos de nucleotídeo único do genoma central (cgSNPs) foram realizadas usando genomas anotados no Prokka v.1.14.6. O genoma central foi determinado utilizando o Roary v.3.13.0 , e o SNP-sites v2.5.1 foi usado para extrair SNPs dos genomas centrais alinhados. A árvore filogenética de máxima verossimilhança (ML) baseada nos cgSNPs foi construída com o software IQ-TREE v2.3.6 . A topologia, anotação e análise da árvore foram determinadas utilizando o MEGA v.11.0.13. No total, 21 isolados apresentaram perfil de resistência ao ciprofloxacino (21/202; 10,3%) e 32 (32/202; 15,8%) isolados foram positivos para algum dos genes de resistência pesquisados. O gene PMQR mais frequente foi o aac(6’)-Ib-cr, encontrado em 13,8% dos isolados (28/202), seguido por qnrS (4,9%, 10/202) e qnrB (2,4%, 5/202). O gene qnrA não foi detectado em nenhum isolado. Entre os 32 isolados que abrigavam genes de resistência à quinolona, apenas 13 (40,6%) eram resistentes ao ciprofloxacino sendo que 7 (21,8%) apresentaram CIM ≥ 32 μg/mL, um isolado (3.1%) apresentou CIM de 16 μg/mL e três isolados (9,3%) apresentaram CIM = 8 μg/mL. O MLST revelou que todos os isolados sequenciados pertenciam a STs diferentes, e as análises do PlasmidFinder identificaram 10 grupos de incompatibilidade (Inc) de plasmídeos entre os isolados sequenciados, sendo o IncFII o mais prevalente, sendo encontrado somente em isolados de origem clinica (3/7; 42,8%). Foi possível identificar o gene qnrS1 em um plasmídeo do tipo IncR (MSU0060) e o gene qnrB19 em um plasmídeo do tipo Col(pHAD28) (MSU0183). Os isolados de efluentes e os isolados clínicos não apresentaram plasmídeos dos mesmos tipos Inc. Além disso, a análise filogenética baseada em 3178 SNPs de genoma central revelou que os isolados de E. coli de águas residuais formam um clado separado dos isolados clínicos. No geral, observamos baixas taxas de resistência em isolados de águas residuais, e não observamos conexão epidemiológica clara com os isolados de pacientes hospitalares. Além disso, os plasmídeos encontrados nos isolados de E. coli de origem clínica não foram os mesmos encontrados nos de origem ambiental. Isso pode ocorrer devido ao fato da pressão seletiva em ambientes aquáticos ser significativamente menor do que em ambientes hospitalare; porém, para obter um melhor panorama sobre a disseminação da resistência nestes ambientes, se faz necessária a tipagem de plasmídeos de um N maior de isolados. A epidemiologia baseada em águas residuais segue se destacando como uma ferramenta importante para entender a persistência e a disseminação de padrões de resistência, auxiliando na tomada de medidas e criação de estratégias para desacelerar a disseminação da resistência antimicrobiana.