Avaliação do efeito de vesículas extracelulares de carcinoma hepatocelular sob parâmetros de ativação da linhagem LX-2 de células estreladas hepáticas

Abstract

As células estreladas hepáticas (HSCs) são o principal tipo celular responsável pela secreção de matriz extracelular (ME) no fígado. Em situações de dano hepático crônico ocorre o acúmulo de ME, causando fibrose hepática que pode evoluir para cirrose ou carcinoma hepatocelular (CHC). A transdiferenciação das HSCs de um fenótipo quiescente, capaz de estocar gotas lipídicas, para o fenótipo ativado secretor de proteínas de ME é o evento chave no desenvolvimento da fibrose. A LX-2 é uma linhagem de HSCs usada em modelos in vitro de fibrose hepática, que pode ter seu fenótipo modulado pela concentração de soro fetal bovino (SFB) no meio de cultivo, com baixas concentrações tornando-as quiescentes, e altas concentrações levando à ativação. O CHC é o tipo de câncer de fígado mais letal, cujo desenvolvimento ocorre em quadros de fibrose avançada. O microambiente tumoral tem uma participação importante no desenvolvimento do CHC, com a ativação de HSCs em fibroblastos associados ao câncer (CAFs) impactando diretamente na agressividade da doença e resposta à quimioterápicos. Vesículas extracelulares (VEs) atuam na comunicação celular pela transferência de moléculas variadas, com impacto no estado fisiológico e patológico. O objetivo deste trabalho é testar o modelo de ativação das LX-2 pela concentração de SFB no meio de cultivo, e então, avaliar o efeito de vesículas extracelulares provenientes da linhagem HepG2, em parâmetros de ativação da linhagem LX-2. A linhagem LX-2 foi exposta ao meio de cultivo DMEM high glucose suplementado com 2% ou 10% SFB, para comparação dos principais marcadores do fenótipo ativado. A biomassa celular foi avaliada pelo ensaio de Sulforrodamina B, a presença de gotas lipídicas foi avaliada pelo ensaio de AdipoRed, a expressão proteica de colágeno e da proteína Ki-67, marcadora da proliferação celular, foram feitos por citometria de fluxo. Foi avaliada também, a expressão gênica de ColIa1, TGFβ e ACTA2 por RT-PCR, e quantificação da migração celular pelo ensaio de Wound healing. As vesículas extracelulares foram isoladas da linhagem HepG2 por ultracentrifugação, e tiveram tamanho e número de partículas identificados por NTA, e morfologia visualizada por MET. As células LX-2 foram expostas às vesículas de HepG2 (HepG2-VEs) à 20 μg/mL e tiveram a viabilidade avaliada pelo ensaio de MTT e morte celular avaliada por Anexina/PI e os demais parâmetros de ativação analisados em citometria de fluxo. A comparação do cultivo de LX-2 com 2% e 10% demonstrou um aumento na biomassa e no conteúdo de gotas lipídicas em 10%, e da expressão proteica de COLIa1, junto de uma tendência ao aumento da expressão gênica de ACTA2. O meio 10% SFB também provocou diminuição na proliferação, mas não afetou a expressão gênica de TGFβ e ColIa1, nem a migração celular. A exposição à HepG2-VEs provocou a diminuição na viabilidade de LX-2 e no conteúdo de gotas lipídicas, aumento na proliferação celular, e na expressão de colágeno. Não foi observada diferença significativamente estatística nos parâmetros de morte celular. Não podemos afirmar que as células mantidas em 2% de SFB estão quiescentes em contraponto às mantidas em 10% SFB ativadas. A partir das tendências observadas no aumento na expressão proteica de colágeno e na expressão gênica de ACTA2, é possível que ambos os grupos estejam ativados, mas com subpopulações em um estado mais ativado que outras. Já, a exposição das LX-2 à HepG2-VEs foi capaz de induzir a ativação, observada pela redução de gotas lipídicas, e aumento na expressão proteica de colágeno e da proliferação celular. É possível que, a diminuição na atividade mitocondrial seja decorrente de um reajuste metabólico, levando as células à um perfil mais glicolítico. Tais resultados demonstram a capacidade das VEs de CHC modularem as HSCs recipientes ao fenótipo de miofibroblastos.

Hepatic stellate cells (HSCs) are the primary cell type responsible for extracellular matrix (ECM) secretion in the liver. Chronic liver injury leads to ECM accumulation, causing hepatic fibrosis which can progress to cirrhosis or hepatocellular carcinoma (HCC). The transdifferentiation of HSCs from a quiescent phenotype, capable of storing lipid droplets, to an activated phenotype secreting ECM proteins is the key event in fibrosis development. LX-2 is an HSC cell line used in in vitro models of hepatic fibrosis, and its phenotype can be modulated by fetal bovine serum (FBS) concentration in the culture medium, with low concentrations inducing quiescence and high concentrations leading to activation. HCC is the deadliest type of liver cancer, developing in the context of advanced fibrosis. The tumor microenvironment plays an important role in HCC development, with HSC activation into cancer-associated fibroblasts (CAFs) directly impacting disease aggressiveness and response to chemotherapy. Extracellular vesicles mediate cell-to-cell communication by transferring various molecules, influencing physiological and pathological states. The aim of this study was to test the model of LX-2 activation by FBS concentration in the culture medium and then to evaluate the effect of extracellular vesicles from the hepatoblastoma cell line HepG2 on LX-2 activation parameters. The LX-2 cell line was exposed to DMEM high glucose medium supplemented with 2% or 10% FBS to compare the main markers of the activated phenotype. Cell biomass was assessed by the Sulforhodamine B assay, lipid droplet presence was evaluated by the AdipoRed assay, and protein expression of collagen and Ki-67, a proliferation marker, was analyzed by flow cytometry. Gene expression of ColIa1, TGFβ, and ACTA2 was also evaluated by RT-PCR, and cell migration was quantified by the wound healing assay. Extracellular vesicles were isolated from the HepG2 cell line by ultracentrifugation, and particle size and number were identified by NTA, with morphology visualized by TEM. LX-2 cells were exposed to HepG2 vesicles (HepG2-VEs) at 20 μg/mL, and viability was assessed by the MTT assay, cell death by Annexin/PI, and other activation parameters were analyzed by flow cytometry. Comparison of LX-2 cultures with 2% and 10% FBS showed an increase in biomass and lipid droplet content at 10%, and in COLIa1 protein expression, along with a trend toward increased ACTA2 gene expression. The 10% FBS medium also caused a decrease in proliferation but did not affect TGFβ and ColIa1 gene expression or cell migration. Exposure to HepG2-VEs caused a decrease in LX-2 viability and lipid droplet content, an increase in cell proliferation, and collagen expression. No statistically significant difference was observed in cell death parameters. It cannot be stated that cells maintained in 2% FBS are quiescent in contrast to those maintained in 10% FBS activated. Based on the trends observed in the increase in collagen protein expression and ACTA2 gene expression, it is possible that both groups are activated, but with subpopulations in a more activated state than others. On the other hand, exposure of LX-2 to HepG2-VEs was able to induce activation, observed by the reduction of lipid droplets and increase in collagen protein expression and cell proliferation. The decrease in mitochondrial activity may be due to a metabolic readjustment, leading cells to a more glycolytic profile. These results demonstrate the ability of HCC EVs to modulate recipient cells to the myofibroblast phenotype.