Efeito do canabidiol sobre a hiperexcitabilidade neuronal em modelo animal de malformação cortical

Abstract

A epilepsia é um dos principais transtornos neurológicos, afetando cerca de 70 milhões de indivíduos, e é caracterizada pela presença de crises epilépticas espontâneas e recorrentes. Aproximadamente 40% das epilepsias refratárias, que não respondem adequadamente ao tratamento farmacológico atualmente disponível, estão associadas a malformações do desenvolvimento cortical (MDC) principalmente em crianças. A polimicrogiria (PMG), um exemplo de MDC, é caracterizada por anormalidades na organização das células corticais e formação excessiva de giros corticais, propiciando a formação de uma zona epileptogênica. Cerca de 70% das crianças com PMG apresentam crises epilépticas refratárias. Terapias alternativas para as epilepsias refratárias, como o uso do canabidiol (CBD), um derivado da Cannabis sativa, têm mostrado um potencial anti-crise em estudos clínicos e pré-clínicos. Neste trabalho, utilizamos modelo animal de malformação cortical em ratos Wistar induzida por criolesão cortical bilateral neonatal para avaliar o efeito do CBD sobre a hiperexcitabilidade neuronal em duas fases do desenvolvimento (P21 – P30: Idade juvenil; P35 – P60: Idade adolescente) por meio de registros eletrofisiológicos extracelulares in vitro. A criolesão cortical bilateral neonatal (P0 – P1) foi realizada na região do córtex somatossensorial para formação de um microgiro (MDC), a partir do contato de uma probe metálica congelada em nitrogênio líquido. Nos animais controle (Sham) a probe foi mantida à temperatura ambiente. O efeito do CBD foi avaliado em fatias cerebrais coronais (400μm) na presença de líquido cefalorraquidiano artificial modificado (LCRAm) sem magnésio (0Mg2+) e na presença de 4-aminopiridina (4AP). O registro extracelular in vitro foi realizado na região cortical paramicrogiral nos animais MDC, ou na região cortical correspondente nos animais Sham. Ao perfundir as fatias com LCRAm (0Mg2+ + 4AP) simultaneamente com CBD para avaliar sua ação sobre a atividade epileptiforme induzida, observamos que a frequência dos eventos ictais e o número de eventos de maior duração (>100 seg.) foram menores que as fatias perfundidas somente com LCRAm (0Mg2+ + 4AP) nos animais Sham e MDC na idade adolescente. Ao perfundir as fatias primeiramente com LCRAm (0Mg2+ + 4AP) e adicionando CBD posteriormente, para avaliar seu potencial em diminuir a atividade epileptiforme previamente induzida, detectamos aumento na frequência de eventos ictais e diminuição o número de eventos de longa duração (>25 seg.) nas fatias dos animais Sham e MDC em idade adolescente, além do aumento do número de eventos de maior duração (>100 seg.) nas fatias dos animais MDC na idade juvenil, em relação ao período anterior à adição de CBD. Finalmente, ao perfundir as fatias primeiramente com CBD seguido de LCRAm (0Mg2+ + 4AP) + CBD para verificar sua capacidade de prevenir a atividade epileptiforme induzida, observamos que o CBD previamente adicionado diminuiu tanto a geração de eventos ictais longos (>25 seg.) nas fatias dos animais MDC quanto eventos ictais de maior duração (>100 seg.) além de reduzir a frequência de eventos ictais nas fatias dos animais Sham e MDC na idade juvenil. Nossos achados sugerem que, apesar de o CBD não demonstrar efeito importante sobre a hiperexcitabilidade previamente induzida, ele apresenta um potencial de atenuar a intensidade e reduzir a geração da atividade epileptiforme.

Epilepsy is a leading neurological disorder, affecting approximately 70 million people worldwide, and is characterized by spontaneous and recurrent seizures. Around 40% of refractory epilepsies, which are resistant to currently available pharmacological treatment, are associated with developmental cortical malformation (DCM), primarily in children. Polymicrogyria (PMG), a type of DCM, is characterized by abnormal cortical cell organization and an increased number of cortical gyri, which contribute to the formation of an epileptogenic zone. About 70% of children with PMG present refractory seizures. Alternative therapies for refractory epilepsies, such as cannabidiol (CBD) a derivative of Cannabis sativa have shown promising anti-seizure effects in both clinical and preclinical studies. In this study, we used an animal model of cortical malformation in Wistar rats by performing neonatal bilateral cortical freeze-lesion to evaluate the effect of CBD on neuronal hyperexcitability during two developmental stages (P21 – P30: juvenile age; P35 – P60: adolescence) through in vitro extracellular electrophysiological recordings. The neonatal cortical freeze-lesion (P0 – P1) was performed in the bilateral somatosensory cortex to induce microgyria (MDC), using a metal probe cooled in liquid nitrogen. In control animals (Sham), the probe was kept at room temperature. The effect of CBD was evaluated in coronal brain slices (400μm) in the presence of modified artificial cerebrospinal fluid (mACSF) without magnesium (0Mg2+) and with 4-aminopyridine (4AP). In vitro extracellular recordings were performed in the paramicrogyral cortical region in DCM animals and in the corresponding cortical region in Sham animals. Slices were perfused with mACSF (0Mg2+ + 4AP) simultaneously with CBD, to evaluate the effect of CBD on induced epileptiform activity. We observed that the frequency of ictal events and the number of longer duration events (>100 sec.), were lower than in slices perfused with mACSF (0Mg2+ + 4AP) alone, both in Sham and DCM adolescent animals. Next, the slices were first perfused with mACSF (0Mg2+ + 4AP), and the CBD was added subsequently to assess the potential of CBD to reduce previously induced epileptiform activity. We detected an increase in the frequency of ictal events and a decrease in the number of long-duration events (>25 sec.) in slices from both Sham and DCM animals at the adolescent age. Furthermore, there was an increased number of longer duration events (>100 sec.) in slices from DCM juvenile animals compared to the period before CBD addition. Finally, the slices were first perfused with CBD followed by mACSF (0Mg2+ + 4AP) + CBD to evaluate its ability to prevent induced epileptiform activity. We observed that the previously added CBD reduced the generation of long-duration ictal events (>25 sec) in slices from DCM animals as well as ictal events of longer duration (>100 sec), while also reducing the frequency of ictal events in slices from both Sham and DCM juvenile animals. Our findings suggest that, although CBD does not show a significant effect on previously induced hyperexcitability, it has the potential to attenuate the intensity and reduce the generation of epileptiform activity.