Avaliação de parâmetros neuroquímicos e moleculares para elucidação da fisiopatologia do dano neurológico da COVID-19

Abstract

A pandemia desencadeada pelo coronavírus SARS-CoV-2, denominada pela Organização Mundial da Saúde como Coronavirus disease 2019 (COVID-19), foi enquadrada como ameaça à saúde pública mundial devido aos seus impactos socioeconômicos e sanitários. O quadro sintomatológico da COVID-19 envolve, principalmente, alterações nas vias respiratórias, porém um considerável número de pacientes apresenta manifestações neurológicas possivelmente relacionadas a quadros neuroinflamatórios e vasculares. Saliente-se ainda que essas manifestações têm sido observadas também após a infecção viral, caracterizando o quadro chamado de COVID longa. Para elucidar os mecanismos envolvidos na disfunção neurológica, nos capítulos I e II desta tese, foram analisados parâmetros de inflamação, reatividade glial e função mitocondrial em fatias de cérebro de ratos expostas ao soro de pacientes infectados pelo SARS-CoV-2. Amostras de sangue de pacientes positivados para SARS-CoV-2 foram coletadas no Grupo Hospitalar Conceição, Porto Alegre, RS, e os soros foram então separados. Foram utilizados ratos Wistar de 365 dias de vida (escolhidos devido a relação de vítimas da COVID-19 associado à idosos no Brasil), os quais foram eutanasiados e os tecidos cerebrais de interesse (córtex cerebral e hipocampo) foram dissecados e fatiados coronariamente. As fatias foram incubadas a 30° C por 2 h com os seguintes tratamentos: (i) solução salina contendo soro (10% v/v) de um indivíduo controle; ii) solução salina contendo soro (10% v/v) de dois pacientes SARS-CoV-2 positivos (variantes Gamma e Zeta do vírus); iii) solução salina contendo soro (10% v/v) de um indivíduo previamente infectado com SARS-CoV-2, mas negativo no momento da coleta de sangue. Ao final do período de incubação, determinamos os níveis de expressão de diferentes proteínas relacionadas à inflamação, reatividade glial e função mitocondrial. Foram observadas alterações em diferentes marcadores inflamatórios tanto no córtex quanto no hipocampo de ratos expostos ao soro dos pacientes. Também foi verificada uma redução dos genes envolvidos na biogênese e dinâmica mitocondrial e marcadores de reatividade glial como a S100B. Já o capítulo III apresenta um artigo de opinião hipotetizando que a proteína Tom70 de células gliais poderia ser um alvo relevante para a infecção pelo SARS-CoV- 2, causando alterações na resposta imune do hospedeiro. No capítulo IV da tese, empregamos ferramentas computacionais para investigar os mecanismos moleculares que controlam a interação entre a proteína dimérica Orf9b do SARS-CoV-2 e a proteína mitocondrial Tom70 em diferentes variantes do SARS-CoV-2. Saliente-se aqui que Tom70 é um componente-chave para a indução do sistema antiviral mitocondrial, um processo de resposta imune do hospedeiro desencadeado durante a infecção por SARSCoV- 2. Verificamos que os resíduos Asp415, Glu477 e Asp545 da Tom70 são críticos para a ligação da Orf9b viral. Também encontramos que mutações nas variantes virais Delta e Ômicron causaram a diminuição na interação dos dímeros da Orf9b, facilitando a liberação dos monômeros para interagir com a Tom70. Além disso, comparando as variantes analisadas, observamos que a Delta apresentava a menor diferença de energia entre a conformação dimérica e o complexo com a Tom70, sugerindo uma maior dissociação dos dímeros dessa variante e, portanto, um maior potencial para ligação na Tom70. Nossos resultados mostram que alterações na resposta inflamatória, nos processos de dinâmica e bioegênese mitocondrial, e na reatividade glial podem explicar, ao menos em parte, os eventos neuroquímicos observados em pacientes com COVID-19 e possíveis desfechos clínicos associados ao quadro de COVID longa.

The pandemic caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, named by the World Health Organization as Coronavirus disease 2019 (COVID-19), has been considered a threat to global public health due to its socioeconomic and health impacts. Symptoms of COVID- 19 mainly involve problems in the respiratory tract, but a considerable number of patients present neurological manifestations possibly related to neuroinflammatory and vascular conditions. It should also be noted that these manifestations have also been observed after viral infection, characterizing the condition called long COVID. To elucidate the mechanisms involved in the neurological dysfunction, in chapters I and II of this thesis, we analyzed parameters of inflammation, glial reactivity and mitochondrial function in brain slices of rats exposed to serum from patients infected with SARS-CoV-2. Blood samples from patients positive for SARS-CoV-2 were collected at Grupo Hospitalar Conceição, Porto Alegre, RS, and the sera were then separated. At the age of 365 days (due to the relationship of COVID-19 victims associated with the elderly in Brazil), Wistar rats were euthanized and the brain tissues of interest (cerebral cortex and hippocampus) were dissected and sliced coronally. The slices were incubated at 30°C for 2 h with the following treatments: (i) saline solution containing serum (10% v/v) from a control individual; (ii) saline solution containing sera (10% v/v) from two SARS-CoV-2- positive patients (Gamma and Zeta variants of the virus); (iii) saline solution containing serum (10% v/v) from an individual previously infected with SARS-CoV-2 but negative at the time of blood collection. At the end of the incubation period, we determined the expression levels of different proteins related to inflammation, glial reactivity and mitochondrial function. Changes in different inflammatory markers were observed in both the cortex and hippocampus exposed to patient derived sera. A reduction in the gene expression involved in mitochondrial biogenesis and dynamics and markers of glial reactivity such as S100B was also observed. In the chapter III, we wrote an opinion article hypothesizing that the Tom70 protein of glial cells could be a relevant target for SARSCoV- 2 infection, causing alterations in the normal host immune response. In chapter IV of this thesis, we used computational tools to investigate the molecular mechanisms that control the interaction between the SARS-CoV-2 dimeric protein Orf9b from different viral variants and the mitochondrial protein Tom70. It should be noted here that Tom70 is a key component for the induction of the mitochondrial antiviral system, a host immune response process triggered during SARS-CoV-2 infection. We found that residues Asp415, Glu477 and Asp545 of Tom70 are critical for viral Orf9b binding. We also discovered that changes in the Delta and Omicron variants cause a decrease in the interaction of Orf9b dimers, facilitating the release of monomers to interact with Tom70. Furthermore, comparing the analyzed variants, we observed that Delta presented a smaller energy difference between the dimeric and complex conformation like Tom70, suggesting a greater dissociation of this variant's dimers and, therefore, a greater binding potential to Tom70. Our results show that alterations in the inflammatory response, mitochondrial dynamics and biogenesis, and glial reactivity may explain, at least in part, the neurochemical events observed in patients with COVID-19 and possible clinical outcomes associated with long COVID.