Estudo do floroglucinol uliginosina B : ação sobre o sistema purinérgico, toxicidade e predição das propriedades ADMET/drug-likeness in silico

Abstract

A uliginosina B (ULI) é um acil-fluroglucinol dimérico presente em espécies de Hypericum nativas da América do Sul. Para esse trabalho, foi obtido de H. polyanthemum. Estudos anteriores relataram que ULI possui efeitos do tipo antidepressivo e antinociceptivo em roedores, efeitos estes que parecem pelo menos em parte estar relacionados à sua capacidade de inibir a recaptação neuronal de monoaminas, especialmente de dopamina, e de aumentar a disponibilidade de adenosina cerebral. Esse floroglucinol tem sido considerado uma molécula promissora para o desenvolvimento de farmacos neuroativos. Contudo, o seu perfil farmacocinético não foi estabelecido e os estudos de toxicidade, embora indiquem segurança para neurônios sadios, são ainda limitados em número e natureza. Com isso, os objetivos dessa tese foram: aprofundar o estudo da interação da ULI com o sistema purinergico e dopaminérgico; avaliar sua toxicidade em linhagem celular de hepatocarcinoma HepG2 e no modelo Caenorhabditis elegans; e realizar uma predição in silico das suas propriedades ADMET/drug-likeness. A ULI diminuiu a hidrólise de ATP (CI50 127 μM) e ADP (70% apenas com ULI 100 μM) , mas não afetou a hidrólise de AMP, em sinaptossomos estriatais de ratos. A análise in silico, através do programa GOLD, indicou interação com resíduos de aminoácidos nos sítios ativos da enzima ecto-5’-nucleotidase, porém sem interação com os sítios do zinco. O estudo in vitro com enzima ecto-5’-nucleotidase humana isolada demonstrou que a ULI (1 – 1000 μM) não altera a atividade da enzima. Tomados em conjunto, esses resultados mostram que ULI não altera a atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase, mas provoca alterações na cascata do sistema purinérgico, possivelmente através da inibição da atividade das enzimas NTPDases, com o acúmulo de ATP extracelular, o que pode contribuir para o efeito do tipo antidepressivo demonstrado em estudos anteriores. No modelo C. elegans, ULI apresentou toxicidade aguda (CI50 14 μM) na cepa selvagem (N2). Mas não afetou a reprodução, nem o desenvolvimento corporal dos nematódeos, o que indica uma resposta adaptativa aos efeitos tóxicos agudos da ULI. Na cepa knouckout para glicoproteina-P (NL131) não afetou a sobrevivência dos nematódeos, indicando que seu mecanismo de toxicidade pode ser dependente da entrada via glicoproteina-P. Os dados obtidos na cepa BY 200 (neurônios dopaminérgicos marcados com GFP) demonstraram ação dopaminérgica e sugerem que em alta concentração (20 μM) a ULI induz uma neurodegeneração leve e internalização do transportador neuronal de dopamina (DAT-1). A ULI apresentou efeito citotóxico na linhagem celular HepG2 (CI50 de 3,5 μM, 6,5 μM e 7,5 μM, com 24, 48 e 72 horas de incubação, respectivamente), sugerindo hepatotoxicidade. Os dados das propriedades ADMET/drug-likeness, preditas pelos programas ACD/Percepta, SwissADME e pkCSM-pharmacokinetics, indicam que a ULI apresenta boas propriedades drug-likeness, seguindo a regra dos cinco de Lipinski. Contudo, pode apresentar problemas de absorção passiva pelo trato grastrointestinal e baixa penetração no SNC. Foi predita também como substrato para glicoproteína-P e CYP3A4. Em conclusão, os resultados obtidos nesta tese reforçam a hipótese de interação da uliginosina B com o sistema purinérgico e dopaminérgico, sugerem toxicidade hepática e envolvimento de transportadores para a passagem da ULI através das membranas biológicas. Assim, considerando a fase em que esse trabalho se encontra dentro do desenvolvimento de fármacos, os dados apontam para a continuidade dos estudos com a uliginosina B, tendo como perspectivas imediatas estudos do perfil farmacocinético in vivo e de toxicidade em mamíferos.

Uliginosin B (ULI) is a dimeric acyl-fluoroglucinol present in species of Hypericum native to South America. For this work, it was obtained from H. polyanthemum. Previous studies have reported that ULI has antidepressant-like and antinociceptive-like effects in rodents, effects that seem at least in part to be related to its ability to inhibit neuronal reuptake of monoamines, especially dopamine, and to increase brain adenosine availability. This phloroglucinol has been considered a promising molecule for the development of neuroactive drugs. However, its pharmacokinetic profile has not been established and toxicity studies, although indicating safety for healthy neurons, are still limited in number and nature. With that, the objectives of this thesis were: to deepen the study of the interaction of the ULI with the purinergic and dopaminergic system; to evaluate its toxicity in HepG2 hepatocarcinoma cell line and in the Caenorhabditis elegans model; and perform an in silico prediction of its ADMET/drug-likeness properties. ULI decreased ATP (IC50 127 μM) and ADP (70% with ULI 100 μM only) hydrolysis, but did not affect AMP hydrolysis, in rat striatal synaptosomes. The in silico analysis, using the GOLD program, indicated interaction with amino acid residues in the active sites of the ecto-5'-nucleotidase enzyme, but without interaction with the zinc sites. The in vitro study with isolated human ecto-5'-nucleotidase enzyme showed that ULI (1 – 1000 μM) does not alter the activity of the enzyme. Taken together, these results show that ULI does not alter the activity of the ecto-5'-nucleotidase enzyme, but causes alterations in the purinergic system cascade, possibly through the inhibition of the activity of the NTPDases enzymes, with the accumulation of extracellular ATP, which may contribute to the antidepressant-like effect demonstrated in previous studies. In the C. elegans model, ULI showed acute toxicity (IC50 14 μM) in the wild type (N2) strain. But it did not affect reproduction or body development of the nematodes, which indicates an adaptive response to the acute toxic effects of ULI. In the knouckout strain for P-glycoprotein (NL131) it did not affect nematode survival, indicating that its toxicity mechanism may be dependent on entry via P-glycoprotein. Data obtained from the BY 200 strain (GFP-labeled dopaminergic neurons) demonstrated dopaminergic action and suggest that at high concentration (20 μM) ULI induces mild neurodegeneration and internalization of the neuronal dopamine transporter (DAT-1). ULI had a cytotoxic effect on the HepG2 cell line (IC50 of 3.5 μM, 6.5 μM and 7.5 μM, with 24, 48 and 72 hours of incubation, respectively), suggesting hepatotoxicity. Data on ADMET/drug-likeness properties, predicted by the ACD/Percepta, SwissADME and pkCSM-pharmacokinetics programs, indicate that ULI has good drug-likeness properties, following Lipinski's rule of five. However, it can present problems of passive absorption by the gastrointestinal tract and low penetration in the CNS. It was also predicted as a substrate for P-glycoprotein and CYP3A4. In conclusion, the results obtained in this thesis reinforce the hypothesis of interaction of uliginosin B with the purinergic and dopaminergic system, suggest liver toxicity and involvement of transporters for the passage of ULI through biological membranes. Thus, considering the phase in which this work is in the development of drugs, the data point to the continuity of studies with uliginosin B, with immediate perspectives studies of the pharmacokinetic profile in vivo and toxicity in mammals.