Padronização de protocolo de imunofluorescência em microscopia confocal para avaliação de alterações bioquímicas e citomorfológicas induzidas pela neurotoxina 6-hidroxidopamina à linhagem celular SH-SY5H

Abstract

Um dos grandes desafios no estudo sobre a Doença de Parkinson (DP) é a elucidação da fisiopatologia dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal durante a progressão da DP. Utilizando a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, diferenciada em linhagem tipo neurônio dopaminérgico, como modelo in vitro para estudos moleculares da DP são descritos estudos que avaliam, bioquímica e morfologicamente, os eventos descritos na patologia da DP. Sabe-se que a oxidação da proteína cofilina-1 medeia disfunção mitocondrial e apoptose em células tumorais e, pode potencialmente desempenhar um papel importante na morte de células neuronais induzidas por neurotoxinas como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA), uma droga comumente usada para indução de DP em animais. Estudos com esta linhagem demonstram a translocação de cofilina-1 do citosol para a mitocôndria durante tratamento com 6-OHDA, entretanto nenhum estudo utiliza técnicas de microscopia para avaliação desde fenômeno. A microscopia é uma das técnicas descritas como menos invasiva, por manter a estrutura celular, permitindo a observação das características bioquímicas e morfológicas das células. Contudo, ainda são necessários aprimoramentos e a implementação de bons protocolos para utilização de equipamentos já bastante difundidos no meio científico, como a microscopia, possibilitando a utilização dessa ferramenta de estudo para diversos tipos celulares, cultivos, tecidos e amostras. Dessa forma, este trabalho se propõe a descrever um bom protocolo de imunofluorêscencia para microscopia confocal que tenha foco na morfologia celular e do seu conteúdo interno, como a distribuição de cofilina-1 nas células SH-SY5Y quando desafiada por 6-OHDA, utilizando parâmetros bioquímicos para validar o protocolo proposto. Nosso objetivo em desenvolver um protocolo de imunofluorêscencia para esta linhagem celular foi bem sucedido e validado pela apresentação de fragmentação mitocondrial durante tratamento com a neurotoxina, como descrito na literatura. Entretanto, não foi possível avaliar o comportamento de cofilina-1 pelo método utilizado neste momento, sendo necessárias repetições. De toda forma, este trabalho aborda pontos importantes a serem questionados ao trabalhar com as técnicas de imunofluorêscencia, orientando o leitor formas e pontos críticos, tornando possível adaptar um protocolo de imunofluorêscencia a todo tipo de amostra biológica para microscopia confocal.