Modulação da homeostase de zinco em macrófagos durante a interação com Cryptococcus neoformans

Abstract

A levedura basidiomicética Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da criptococose, patologia que pode acometer diferentes órgãos do hospedeiro, incluindo pele, pulmões e sistema nervoso central. O ciclo infeccioso se inicia com a deposição de partículas infecciosas nas vias aéreas do hospedeiro. Neste ambiente, o micro-organismo se depara com diversas limitações impostas pelo hospedeiro para conter a progressão da infecção, sendo uma delas denominada imunidade nutricional, caracterizada pela criação de um ambiente com restrita disponibilidade de nutrientes. Visto que a privação de zinco constitui um exemplo de imunidade nutricional, os mecanismos de captação e metabolismo deste metal possivelmente estão relacionados ao processo de interação patógeno-hospedeiro. Portanto, o objetivo deste projeto foi avaliar a modulação da homeostase do metal zinco em macrófagos e a sua influência na atividade fungicida dessas células. Em ensaios de viabilidade celular de macrófagos murinos em concentrações crescentes de cloreto de zinco (ZnCl2) ou do quelante de zinco DTPA, foi observada redução drástica da viabilidade celular apenas em concentrações de ZnCl2 superiores a 500 μM. A taxa de desenvolvimento de C. neoformans foi alterada apenas na ausência de zinco (concentrações superiores a 50 μM de DTPA). Para avaliar se a privação de zinco influencia a atividade fungicida de macrófagos, realizamos testes de viabilidade de C. neoformans após a interação com células de macrófagos murinos. Observamos que a privação de zinco levou a menor atividade fungicida de macrófagos; entretanto, células de C. neoformans previamente tratadas com o quelante de zinco TPEN se mostraram mais sensíveis à atividade fungicida de macrófagos. Levando em consideração que a privação de zinco altera a sensibilidade de C. neoformans à atividade fungicida de macrófagos, foi realizada análise quantitativa dos níveis de transcritos de 10 genes da família ZnT e 4 genes da família ZIP de transportadores de zinco. Os genes ZnT-1, ZnT-5, ZnT-6 e ZnT-7 apresentaram uma redução significativa dos níveis relativos de transcritos após 3 ou 6 horas de interação com C. neoformans. Esta mesma redução foi observada para os níveis relativos dos transcritos referentes aos genes ZIP1, ZIP8, ZIP13 e ZIP14. Em ensaios para avaliar se ocorre mobilização de zinco intracelular em células de macrófagos durante a interação com Cryptococcus, não houve diferença significativa, sugerindo que os transportadores de zinco ZnT e ZIP não estão envolvidos na homeostase de zinco durante a infecção por C. neoformans, e que existem outros mecanismos que regulam a homeostase de zinco em macrófagos durante a infecção por essa levedura.

The basidiomycetic yeast Cryptococcus neoformans is the etiological agent of cryptococcosis, pathology that affects different organs in the host, including skin, lungs and central nervous system. The infectious cycle begins with the deposition of infective particles in the respiratory tract. In this environment, the microorganism faces several limitations imposed by the host to contain the spread of the infection, one of them called nutritional immunity, characterized by the creation of an environment with limited nutrient availability. Since zinc deprivation is one example of nutritional immunity, mechanisms of uptake and metabolism of this metal are possibly related to host-pathogen interaction. Hence, the aim of the present study was to evaluate the modulation of zinc homeostasis in macrophages and its influence on antifungal activity of these cells. To evaluate if external zinc availability affects the antifungal properties of macrophages, the cell viability of murine macrophages was assessed in increasing concentrations of zinc chloride (ZnCl2) or zinc chelator DTPA; the cell viability was drastically decreased in ZnCl2 concentrations above 500 μM. The growth rate of C. neoformans was altered in the lack of zinc (concentrations above 50 μM of DTPA). To evaluate if zinc deprivation affects the antifungal activity of macrophages, we performed viability tests of C. neoformans after interaction with macrophages. We observed that zinc deprivation led to lower antifungal activity; meanwhile, fungal cells pretreated with zinc chelator TPEN were more susceptible to antifungal activity of macrophages. Since zinc deprivation alters the sensitivity of C. neoformans to antifungal activity of macrophages, the relative transcript levels of 10 ZnT zinc transporters and 4 ZIP zinc transporters were quantified. ZnT-1, ZnT-5, ZnT-6 and ZnT-7 showed a significant decrease in expression after 3 and 6 hours of interaction with C. neoformans as well as ZIP1, 8, 13 and 14. We performed assays to evaluate if there is intracellular zinc mobilization in macrophages infected with C. neoformans, however the results had no statistical difference, suggesting that zinc transporters ZnT and ZIP are not involved in zinc homeostasis during cryptococcal infection, and that are other mechanisms involved in zinc homeostasis in macrophages during infection by C. neoformans.