Expressão de genes codificadores de versões truncadas da urease de Canavalia ensiformis em plantas

Abstract

A agricultura no Brasil cresce a cada ano juntamente à necessidade da produção de maiores quantidades de alimentos. Os danos causados por insetos e fungos nas plantações podem representar grandes perdas e prejuízo aos agricultores e, por isso, novas abordagens para o melhoramento destas culturas são necessárias. As ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a reação de hidrólise da ureia para formar amônia e dióxido de carbono. As ureases são encontradas em plantas, fungos e bactérias, mas não em animais. A urease da semente de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco ou jack bean) possui três isoformas cujas propriedades inseticida e antifúngica, em maior ou menor grau, já foram comprovadas. Tendo em vista que insetos e fungos são os principais agentes que causam danos às culturas agrícolas, as ureases representam um grande potencial biotecnológico para o melhoramento vegetal. Pelo presente trabalho, teve-se por objetivo transformar plantas-modelo de tabaco (Nicotiana tabacum SR1) com um gene que codifica um peptídeo interno da urease de C. ensiformis, denominado Jbtx, e regenerar plantas transgênicas resistentes a determinados tipos de insetos e fungos. O plasmídeo contendo a sequência gênica codificadora de Jbtx foi transformado em células de Escherichia coli para clonagem. O plasmídeo e a sequência codificadora foram, então, confirmados por sequenciamento de DNA. Utilizando-se primers especialmente projetados, a região codificadora do peptídeo foi amplificada pela reação em cadeia da DNA-polimerase (PCR) e o fragmento foi combinado ao plasmídeo pENTR/D-TOPO (Invitrogen), obtendo-se clones recombinantes. Por meio de recombinação, de acordo com o sistema Gateway (Invitrogen), o gene Jbtx foi transferido de pENTR/D-TOPO-Jbtx para o plasmídeo binário pK7WG2D (Universidade de Ghent). Em seguida, pK7WG2D-Jbtx foi introduzido em células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 para a transformação genética de N. tabacum SR1. Prosseguiu-se, então, com a transformação de discos foliares de tabaco, na qual se obteve brotos de plantas possivelmente transgênicos. Uma planta foi regenerada a partir dos brotos e se confirmou por PCR que ela é positiva para Jbtx.

Agriculture in Brazil grows every year together with the need for production of larger quantities of food. Damage caused by insects and fungi in crops may represent great losses and injury to farmers and, therefore, new approaches to improve these crops are needed. Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis reaction of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are found in plants, fungi and bacteria, but not in animals. The urease from Canavalia ensiformis seed (jack bean) has three isoforms whose insecticide and fungicide properties, in a greater or lesser degree, have been proven. Considering that insects and fungi are the main agents that cause damage to crops, the urease represents a great biotechnological potential for plant breeding. This work had the objective of transform tobacco model plants (Nicotiana tabacum SR1) with a gene encoding an internal peptide of urease of C. ensiformis, denominated Jbtx, and regenerate transgenic plants resistant to certain kinds of insects and fungi. The plasmid containing the coding gene sequence Jbtx was transformed into Escherichia coli cells for cloning. The plasmid and the coding sequence were confirmed by DNA sequencing. Using especially designed primers, the peptide coding sequence was amplified through polymerase chain reaction (PCR) and the amplified fragment was introduced into pENTR/D-TOPO plasmid (Invitrogen), getting recombinant clones. By recombination, according to Gateway System (Invitrogen), the Jbtx gene was transferred from pENTR/D-TOPO-Jbtx to the binary plasmid pK7WG2D (Ghent University). Then, pK7WG2D-Jbtx was introduced in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 cells to the genetic transformation of N. tabacum SR1. So, it was continued with the transformation of tobacco leaf discs, which were obtained potentially transgenic shoots. One plant was regenerated from the shoots and it was confirmed by PCR that it is positive for Jbtx.