Nova abordagem para análise de autofagia com o marcador Laranja de acridina

Abstract

Autofagia é um processo de degradação intracelular amplamente distribuído entre eucariotos, responsável pela degradação de proteínas envelhecidas e de organelas. Constituintes citoplasmáticos são sequestrados em organelas de dupla membrana, os autofagossomos, que posteriormente se fundem com os lisossomos onde ocorre a degradação do conteúdo autofagocitado por hidrolases ácidas. Esse sistema tem sido implicado em vários processos patológicos e fisiológicos, incluindo o turnover de proteínas e organelas, resposta a privação de nutrientes e morte celular. Vários métodos para avaliação de autofagia estão disponíveis, dentre eles microscopia eletrônica, microscopia de fluorescência, métodos bioquímicos e avaliação dos níveis de expressão de proteínas ligadas ao processo autofágico. Laranja de acridina é um marcador acidotrópico cujas características permitem seu uso como marcador de autofagossomos maduros. Apresenta fluorescência verde ao entrar na célula e ao ficar retido em compartimentos ácidos sua fluorescência é vermelha, o que permite a quantificação do volume dos compartimentos ácidos da célula por citometria de fluxo, sendo um fácil método de triagem para avaliação de autofagia. O atual método de quantificação leva em consideração a fluorescência vermelha absoluta. Propomos, a partir das características físico-químicas do corante laranja de acridina, uma quantificação que leva em conta a razão de fluorescência verde e vermelha. Demonstramos aqui que, em comparação com a abordagem usual de análise de laranja de acridina, os dados obtidos através da nova abordagem de quantificação apresentam maior correlação com os dados obtidos por outros métodos bem estabelecidos em autofagia.