Transformação genética de Arabidopsis thaliana como ferramenta para o estudo funcional de APX-R (Ascorbate Peroxidase-related)

Abstract

A redução do oxigênio molecular a água em organismos aeróbios permitiu a obtenção de energia química de maneira muito mais eficiente, representando um importante ganho adaptativo no metabolismo energético. No decorrer deste processo, porém, moléculas chamadas de espécies reativas de oxigênio (ERO) são formadas. Apesar de tóxicas quando em altas concentrações, as ERO atuam como moléculas sinalizadoras durante o desenvolvimento da planta, além de sinalizar para vias responsivas a estresses bióticos e abióticos. O acúmulo destas moléculas nas células é modulado pela ação do sistema antioxidante, o qual é composto por componentes enzimáticos e não-enzimáticos. As enzimas do tipo ascorbato peroxidase (APX) são codificadas por uma pequena família gênica presente nos genomas de algas e plantas, onde exercem papel fundamental no metabolismo do peróxido de hidrogênio. Trabalhos prévios do nosso grupo revelaram a existência de um gene anotado como provável APX no genoma de arroz (Oryza sativa L.), entretanto, análises filogenéticas mostraram que esta proteína não agrupa com membros da família APX, mas integra uma família distinta de heme peroxidases de classe I, até então desconhecida, a qual foi intitulada ascorbate peroxidase-related (APX-R). Linhagens mutantes de Arabidopsis thaliana com expressão reduzida de APX-R, bem como linhagens transgênicas que superexpressam o gene resultaram em uma diminuição significativa da taxa de germinação das sementes. Na literatura, APX-R de Arabidopsis thaliana é denominada APX6, e foi caracterizada como uma proteína de localização subcelular supostamente citosólica. Nosso grupo, porém, já demonstrou experimentalmente a localização cloroplastídica de APX-R de arroz em protoplastos. Com o propósito de determinar a localização subcelular de APX-R na planta modelo Arabidopsis thaliana, o presente trabalho objetivou a obtenção de linhagens transgênicas superexpressando AtAPx-R fusionada à proteína fluorescente enhanced yellow fluorescente protein (EYFP). Após a transformação e seleção das linhagens transgênicas, estas plantas foram analisadas em microscópio de fluorescência, por meio do qual se pode comprovar a obtenção de linhagens transgênicas superexpressando a proteína recombinante de maneira estável. Estas linhagens servirão para uma análise detalhada em microscopia confocal de forma a determinar a localização subcelular de APX-R em Arabidopsis thaliana.

The reduction of molecular oxygen to water in aerobic organisms allowed the attainment of chemical energy in a much more efficient way, representing an important adaptive gain in the energetic metabolism. During this process, however, molecules known as reactive oxygen species (ROS) are generated. Although toxic in high concentrations, ROS act as signaling molecules during plant development, besides being involved in biotic and abiotic stress responsive pathways. Reactive oxygen species accumulation inside plant cells is modulated by the antioxidant system, which is composed by enzymatic and non-enzymatic components. The ascorbate peroxidase (APX) enzymes are coded by a small gene family present in plant and algae genomes, where they exert an essential role in hydrogen peroxide metabolism. Previous work of our group revealed the existence of a gene annotated as a putative APX in the rice genome (Oryza sativa L.). However, phylogenetic analysis showed that this protein does not cluster with the APX family, but integrates a distinct class I haem peroxidases family, unknown by the date, which was addressed as ascorbate peroxidase-related (APX-R). Mutant lineages of Arabidopsis thaliana with reduced expression of APX-R, as well as transgenic lineages that overexpress this gene showed a significant reduction in the seeds germination rate. In the literature, Arabidopsis thaliana APX-R is known as APX6 and is characterized as a cytosolic protein. Our group, however, has already experimentally shown the chloroplastic localization of APX-R in rice protoplasts. In order to determine the subcellular localization of APX-R in the model plant Arabidopsis thaliana, transgenic lineages overexpressing AtAPX-R fusioned to the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) were generated. After transformation and selection of the transgenic lineages, these plants were analyzed by fluorescence microscopy, through which it was proved the obtainment of transgenic plants stably overexpressing the recombinant protein. These lineages will be useful for a detailed analysis in confocal microscopy in order to determine the subcellular localization of APX-R in Arabidopsis thaliana.