Estudo de uma metodologia analítica para a quantificação de acetato utilizando diferentes estratégias de operação em biorreatores

Abstract

A quantificação de acetato, metabólito produzido por micro-organismos, é muito importante para a otimização de cultivos em biorreator. Uma quantidade de biomassa mais elevada está relacionada a um aumento do número de células que podem expressar a proteína de interesse durante o cultivo. O produto final, visado para a comercialização, é a enzima Lactase, tendo como foco principal empresas do setor alimentício, em especial lácteos. Altas concentrações de acetato podem interferir no andamento do cultivo, tornando-se tóxicas para as células e inibindo o seu crescimento. O acetato é produzido pelas células quando estas encontram-se em meios com limitação de oxigênio e excessos de glicose, de modo que o controle destes parâmetros é fundamental para se atingir altas densidades celulares. Uma maneira de controlar estes nutrientes é utilizando estratégias de alimentação adequadas em biorreatores, de modo que glicose e oxigênio estejam em concentrações necessárias aos micro-organismos. Várias são as estratégias utilizadas na indústria para manter as concentrações de acetato abaixo da inibitória. As estratégias utilizadas neste trabalho foram baseadas nos métodos de vazão de alimentação com o manejo baseado no método do controle do oxigênio dissolvido, conhecido como DO-stat e estratégia não retro-alimentada, baseada na alimentação linear A concentração de acetato foi quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência. O método proposto para a quantificação sofreu alterações em relação a metodologias já descritas, devido a limitações do equipamento disponível na empresa. Deste modo, foi realizada a validação parcial do novo método proposto para esta análise. Outra variável que necessita atenção é a indução da expressão da proteína de interesse. Micro-organismos recombinantes necessitam de um indutor para que, a partir da adição deste indutor, a proteína de interesse possa ser expressa pelas células. Porém, o indutor também pode ser tóxico para o cultivo, de modo que o tempo de indução também foi estudado. Com a avaliação de todos os parâmetros descritos, foi determinada a melhor condição de cultivo para o crescimento da bactéria recombinante, responsável pela produção da enzima Lactase, bem como a análise de custos dos recursos utilizados.

Acetate, a metabolite produced by microorganisms, it is very important to optimize bioreactor cultivations. A higher amount of biomass is related to an increase number of cells that can express the protein of interest during the cultivation. The final product, targeted for commercialization is the Lactase enzyme, focusing mainly on companies in the food sector, especially dairy. High acetate concentrations can interfere the cultivation progress, making it toxic to the cells and inhibiting their growth. Acetate is produced by cells when they are in means with oxygen and glucose excess so the control of these parameters is essential for attaining high cell densities. One way to control these nutrients is using adequate feeding strategies, so that glucose and oxygen concentrations are required in the microorganisms, without excess. There are several strategies used in the industry to maintain concentrations of acetate below the inhibitory. The strategies used in this study were based on flow rate methods with the handling based on oxygen dissolved control method, known as DO-stat and without feedback control, based on a linear rate. The acetate was quantified by high-performance liquid chromatography The proposed method for the quantification had changes to the methods already described, due to limitations of equipment available in the company. Thus, the partial validation was carried out of the proposed new method for this analysis. Another variable that needs attention is the induction. Recombinant microorganisms require an inductor for starting the addition of the inducer, the protein of interest can be expressed by the cells. However, the inducer can be toxic to the crop, so that the induction time was also studied. With the evaluation of all the parameters described, it was determined the best growing conditions for growth of recombinant bacteria, responsible for producing the Lactase enzyme as well as the analysis of cost of resources used.