Análise fenotípica e genotípica de Enterococcus sp. isolados de frango após subcultura no laboratório

Abstract

Enterococos são bactérias que exercem um papel muito importante na produção de vários alimentos fermentados e também podem ser usadas como probióticos. A presença e o crescimento de enterococcos em alimentos fermentados como queijos e lingüiças conferem a esses produtos características organolépticas únicas. Em contrapartida, sua presença nos alimentos também está associada com falta de higiene durante a manipulação. Estes microrganismos também estão relacionados com o desenvolvimento de algumas doenças, como endocardites, septicemia, infecções do trato geniturinário, entre outras. A presença de características de virulência aumenta o potencial de infecção do microrganismo e a severidade da doença a ele relacionada. Com o objetivo de avaliar possíveis modificações fenotípicas e genotípicas de amostras de enterococos isoladas de frango, durante a subcultura destas cepas no laboratório, várias análises foram realizadas como: a presença dos fatores de virulência; proteína de superfície (esp) e gelatinase (gelE), do operon fsr-regulador do gelE, a expressão fenotípica do gelE, a capacidade de formação de biofilme e a resistência a antimicrobianos, desinfetantes e antisépticos. Quarenta isolados de Enterococcus sp. foram avaliados quanto a presença dos genes gelE, esp, operon-fsr, sprE por PCR, a atividade gelatinolítica por testes bioquímicos convencionais, resistência a antimicrobianos, antisépticos e desinfetantes por antibiograma e formação de biofilme pelo método cristal violeta. Todos os testes foram realizados na 1º geração e na 12º geração das cepas. 85% dos isolados produziram gelatinase e em 92,5% dos isolados o gene gelE estava presente na 1º geração. A análise do fsr-operon destes isolados do primeiro cultivo demonstrou que o gene fsrA estava presente em 35 isolados e o fsrC em 37 isolados e a presença destes genes pareceu não ter correlação com a atividade gelationolítica. O gene fsrB estava presente em todos os isolados (35) que apresentaram atividade gelatinolítica sugerindo que a presença deste gene é importante na expressão desta enzima. Após o subcultivo, apenas um isolado perdeu a atividade gelatinolítica e 15 perderam o gene gelE. Doze isolados perderam pelo menos um gene do fsr-operon durante a subcultura, porém nenhum destes perdeu a capacidade de expressar a enzima gelatinase talvez devido à presença do gene fsrB. O gene sprE foi detectado em 34 isolados na primeira geração e na 12º geração em apenas 20 isolados. O gene da proteína de superfície de Enterococcos (Esp), não foi encontrado em nenhum dos isolados. O antibiograma do isolados no primeiro cultivo demonstrou que 100% dos isolados foram sensíveis a ampicilina e a gentamicina, 95% sensíveis a vancomicina, 85% a ciprofloxacina, 5% a tetraciclina, 65% a eritromicina e 52,5% a cloranfenicol tanto na 1º quanto na 12º geração. Após a subcultura a susceptibilidade dos isolados aumentou a eritromicina (67,5%) e ao cloranfenicol (80%). Quanto ao perfil de resistência aos detergentes e anti-sépticos de uso comercial, todos os isolados apresentaram fenótipo de resistentes ao linear alquilbenzeno sulfonato (LAS) e ao triclosan durante a subcultura. Todos isolados foram suscetíveis ao formaldeído, mas se tornaram resistentes ao 8,5% hipoclorito de sódio e a clorexidina durante a subcultura. Em geral, todos os isolados foram formadores de biofilme e a produção de gelatinase parece ser necessária para esta formação. O perfil genético não pareceu ter relação com a formação de biofilme. Tanto o perfil genotípico quanto o fenotípico pode sofrer alterações durante a subcultura das cepas no laboratório.

Enterococci are bacteria that have a very important role in the production of various fermented foods and can also be used as probiotics. The presence and growth of enterococci in fermented foods like cheese and sausages bring to these products unique organoleptic characteristics. However, their presence in foods is also associated with lack of hygiene during handling. These microorganisms are also related to the development of some diseases such as endocarditis, septicemia, genitourinary infections, among others. The presence of virulence characteristics increases the potential infection of the organism and severity of disease related to it. The aim of the present study is analyze the possible changes of phenotypic and genotypic of enterococci isolated from chicken, during the subculture of the strains in the laboratory, the presence of virulence factors: enterococcal surface protein (esp) and gelatinase (gelE), operon-fsr gelE regulator, gelE phenotypic expression, the ability of biofilm formation and antibiotic, disinfectant and antiseptic resistance were determined in samples of enterococci isolated from chicken. The presence of gelE, esp operon-fsr and sprE genes were evaluated by PCR, gelatinase activity were observed by conventional biochemical tests, antibiotics resistance, antiseptics and disinfectants resistance were analyzed by standard disk diffusion method and biofilm formation were detected following the crystal violet staining method in forty enterococci isolates from chicken. All tests were performed in the 1st generation and 12th generation. 85% of the isolates produced gelatinase and in 92.5% of the isolated the gelE gene was present in the 1st generation. The analysis of operon-fsr in the 1st generation of these isolates showed that the fsrA gene was present in 35 isolates and fsrC gene was present in 37 isolates and the presence of these genes seemed to have no correlation with the gelatinase activity. The fsrB gene was present in all isolates (35) with gelatinase activity suggesting that the presence of this gene is important in the expression of this enzyme. After subculture, only one isolate lost the gelatinase activity and 15 isolates lost the gelE gene. Twelve isolates lost at least one gene of the operon-fsr during laboratory subculture, but none of these isolates lost the ability to express the enzyme gelatinase probably due the presence of the fsrB gene. The sprE gene was detected in 34 isolates in the 1st generation and in 12th generation only 20 isolates maintained this gene. The protein surface of enterococci gene (Esp), was not found in any isolate. The antibiogram of the isolates showed that 100% of the isolates were susceptible to ampicillin and gentamicin, 95% susceptible to vancomycin, 85% to ciprofloxacin, tetracycline 5%, 65% to erythromycin and 52.5% to chloramphenicol in the 1st generation. After subculture the susceptibility of isolates to erythromycin (67.5%) and chloramphenicol (80%) increased. As the profile of resistance to detergents and antiseptics for commercial use, all isolates showed resistance phenotype of the linear alkylbenzene sulfonate (LAS) and triclosan during subculture. All isolates were susceptible to formaldehyde, but became resistant to 8.5% sodium hypochlorite and chlorhexidine during the subculture. In general, all isolates were biofilm formers. Gelatinase production appears to be required for biofilme formation. The genetic profile did not appear to have relation with the formation of biofilms. Genotypic and the phenotypic profile may change during the subculture of the strains in the laboratory.