Identificação e caracterização de vesículas extracelulares presentes no líquido hidático de Echinococcus granulosus

Abstract

Helmintos da classe Cestoda são endoparasitos obrigatórios de grande importância no mundo. Algumas espécies do gênero Echinococcus são agentes etiológicos de doenças em humanos e animais domésticos, necessitando de atenção considerável. Hospedeiros intermediários, humanos e ungulados, são afetados pela formação do cisto hidático, estrutura esférica preenchida pelo líquido hidático (LH), formado principalmente no fígado e pulmão. O processo de infecção apresenta diversos mecanismos adaptativos que envolvem a sobrevivência do parasito dependendo da interação molecular entre o parasito e o hospedeiro. Estudos anteriores já demonstraram a presença de proteínas, tanto do hospedeiro quanto do parasito, no LH. Além disso, proteínas sem sinal para exportação foram identificadas no LH e em meio de cultura de protoescólices. Com esses dados, nossa hipótese é que tais proteínas sejam transportadas via vesículas extracelulares (VEs). Este estudo foca no isolamento e caracterização de VEs de LH de cistos férteis e inférteis de Echinococcus granulosus. As VEs foram purificadas por uma série de centrifugações para remoção de restos celulares seguida de duas ultracentrifugações a 100.000 g. Immunoblot, com anticorpos específicos contra enolase e 14-3-3 de Echinococcus spp., foi conduzido para verificar a presença de proteínas que são encontradas frequentemente em VEs e para identificação da proteína fetuína-A do hospedeiro. Uma vez que nossos dados reforçaram nossa hipótese da existência de VEs em LH, conduzimos experimentos de análise das amostras por microscopia eletrônica de transmissão, com o qual foi possível identificar estruturas esféricas “exosome-like”. Baseado na quantidade de proteínas do hospedeiro, como albumina e imunolobulinas, amostras de LH foram selecionadas de cistos hidáticos férteis e inférteis por gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Nestas amostras, a presença da fetuína-A foi analisada por experimentos de immunoblot e immunogold. Posteriormente, as proteínas enolase e 14-3-3 também foram identificadas em experimentos de immunoblot e immunogold. Estudos recentes indicam que VEs são importantes para a relação parasito-hospedeiro. Estudos posteriores baseado em proteômica, para identificar a composição das VEs e a função da fetuína-A no LH, são necessários para elucidar suas importâncias na interação parasito-hospedeiro.

Helminths of the class Cestoda are obligate endoparasites of great biological importance worldwide. Some species of the genus Echinococcus are etiological agents of hydatid disease in humans and domesticated animals and require attention. Intermediate hosts, such as humans and ungulate animals, are affected by the formation of the hydatid cyst, a structure filled with hydatid fluid (HF) in the liver or lungs. The infection process have many adaptive mechanisms that involve the survival of the parasite depending on the molecular interaction between host and parasite. Previous studies showed the presence of proteins in the HF of both host and parasite. Interestingly, proteins without signal peptide were identified in the HF and in protoescoleces culture media. Thus, our hypothesis is that these proteins are transported by extracellular vesicles (EVs). This study focus on the isolation and characterization of EVs from the hydatid fluid of fertile and infertile cysts of E. granulosus. We purified the EVs by a series of centrifugations to eliminate cell debris followed by two ultracentrifugations at 100,000 g. Immunoblot, with specific antibodies against enolase and aldolase from Echinococcus spp., was performed to verify the presence of proteins usually found in EVs and for the identification of the host fetuin-A protein. Since our data supported the hypothesis that the HF contained EVs, we conducted a TEM experiment, which showed spherical exosome-like structures. Based on the amount of host proteins, such as albumin and immunoglobulin, we selected the HF samples from fertile and infertile hydatid cysts by polyacrylamide-SDS gel electrophoresis (SDS-PAGE). In these samples, we analyzed fetuin-A by immunoblot and immunogold experiments. Finally, Echinococcus enolase and 14-3-3 were identified by immunoblot and immunogold experiments in our sample. Recent studies indicate that these vesicles are important to the whole host-parasite relationship. Further studies based on proteomics, to identify the EVs composition and the key role of fetuin-A in the HF, may clarify their importance in the host-parasite interaction.