Sequências nucleotídicas potencialmente capazes de conferir tolerância ao frio e/ou ao congelamento em plantas

Abstract

O gênero Eucalyptus pertence à família Myrtaceae e é composto em sua maioria por arbóreas florestais. Entre as principais espécies deste gênero, E. grandis, E. urophylla, E. dunnii, E. saligna, E. globulus e híbridos destes apresentam destaque na produção de papel e pastas de celulose. Entretanto, as baixas temperaturas registradas no inverno da região sul do Brasil e a ausência de tolerância ao frio e/ou ao congelamento na maioria das espécies de Eucalyptus limitam o crescimento e o desenvolvimento de plantas deste gênero. O desenvolvimento de linhagens híbridas como E. globulus x E. urophylla, combinando espécies de clima temperado e de clima tropical, tem resultado em sucesso no plantio de Eucalyptus em regiões subtropicais. Contudo, as baixas temperaturas e as geadas recorrentes continuam a causar severos danos nas árvores e perdas na produtividade de madeira. Com o objetivo de conferir tolerância às geadas e às baixas temperaturas, foram realizadas buscas por genes candidatos e sequências promotoras responsivas às baixas temperaturas. Desta maneira, o objetivo proposto é testar a capacidade de genes sintéticos em conferir tolerância ao frio e/ou ao congelamento em plantas de Eucalyptus. Paralelamente, por se tratarem de plantas-modelo, Arabidopsis thaliana e Nicotiana tabacum foram transformadas para avaliar o potencial dos genes em relação a tolerância pretendida. Baseados em trabalhos recentes publicados na literatura científica, selecionamos sequências promotoras responsivas ao frio e sequências codificadoras de proteínas. As sequências promotoras escolhidas foram as dos genes Cor15B e pbec1, derivados de A. thaliana e Prunus persiva, respectivamente. As sequências codificadoras de proteínas escolhidas foram as dos genes IRIP1 e AnAFP derivados de Deschampsia antarctica e Ammopiptanthus nanus, respectivamente. As sequências promotoras e codificadoras de proteínas, em conjunto com o terminador do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumafaciens, foram agrupadas em dois cassetes gênicos nomeados Ppbec1-AnAFP-Tnos e PCor15B-IRIP1-Tnos. As sequências nucleotídicas foram enviadas à empresa GenScript (EUA) onde foram sintetizadas e ligadas ao vetor plasmidial pUC57. Ambos os cassetes gênicos Ppbec1-AnAFP-Tnos e PCor15B-IRIP1-Tnos foram isolados do vetor pUC57 com o uso da enzima HindIII e a combinação de HindIII e EcoRI, respectivamente. Posteriormente, os cassetes gênicos foram ligados aos vetores binários pCAMBIA1300 e pCAMBIA2300 (CAMBIA) clivados com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente. Células de A. tumafaciens EHA105 foram transformadas geneticamente por choque térmico com os plasmídeos binários recombinantes e utilizadas para a transformação genética de plantas de A. thaliana e N. tabacum. As caracterizações moleculares e os ensaios de tolerância ao frio e ao IV congelamento em plantas regeneradas serão realizados. Por fim, plantas de E. globulus x E. urophylla também serão transformadas, selecionadas, caracterizadas em nível molecular e testadas quanto à tolerância ao frio e/ou ao congelamento.

The genus Eucalyptus belongs to the Myrtaceae family and its major species are forest trees. Among main species, special forestry importance is given to E. grandis, E. urophylla, E. dunni, E. saligna, E. globulus, and hybrids of these species, most of them employed in the paper and cellulose production. Winter low temperatures in the south region of Brazil and the absence of freeze tolerant traits in Eucalyptus combined to fast growing and high productivity limits considerably the growth and exploitation of the genus in South Brazil. The development of hybrid lineages like E. globulus x E. urophylla, combining a temperate and a tropical species, has proven great success in the forestry of subtropical regions. Nevertheless, erratic and repetitive frost and cold events damage considerably the trees and determine great losses in timber production. In an attempt to improve frost and cold tolerance in Eucalyptus, we have searched candidate genes and cold responsive promoters in the literature and adapted them for plant transformation. Our idea is to test the capacity of these synthetic genes to confer cold or freezing tolerance in Eucalyptus plants. In parallel, Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum have also been employed to evaluable the potential of the genes to render the required tolerance. Based on recent research works available in the scientific literature, we searched for potential protein coding sequences reported to confer cold or freezing tolerance and cold responsive promoters. The promoter sequences selected were Cor15B and pbec1 from A. thaliana and Prunus persica genes, respectively. The protein coding sequences selected were AnAFP and IRIP1 from Ammopiptanthus nanus and Deschampsia antarctica, respectively. Sequences were ligated, together with the nopaline synthase gene terminator from A. tumefaciens, in two different gene cassettes called PCor15B-IRIP1-Tnos and Ppbec1-AnAFP-Tnos. pUC57 plasmidial vector. Both gene cassettes PCor15B-IRIP1-Tnos and Ppbec1- V AnAFP-Tnos were purified from pUC57 using the restriction enzyme HindIII and with the combination of HindIII and EcoRI, respectively. Thereafter, the artificial genes were ligated into pCAMBIA1300 and pCAMBIA2300 binary vectors, cleaved with the same enzymes utilized previously. Agrobacterium tumefaciens EHA105 cells were genetically transformed by heat-shock with the recombinant binary plasmids and then utilized to A. thaliana and N. tabacum transformations. Transgenic plants will be molecularly characterized and, assays will be accomplished to test the cold or freezing tolerance possibly rended to A. thaliana and N. tabacum transgenic plants. Further, E. globulus x E. urophylla plants will be transformed, selected, molecularly characterized and tested to cold or freezing tolerance.