Análise do perfil metabólico e bioenergético de células de adenocarcinoma de pulmão sensíveis e resistentes à cisplatina

Abstract

O câncer de pulmão é o segundo tipo de câncer mais prevalente no mundo e a principal causa de mortes pela doença. O tratamento padrão para pacientes com câncer de pulmão consiste na quimioterapia com agentes como a cisplatina (CDDP). Porém, a alta incidência de resistência tumoral à CDDP limita o sucesso do tratamento. Diversos estudos têm utilizado modelos celulares para o entendimento de mecanismo moleculares envolvidos na resistência do câncer a CDDP. Células tumorais podem mudar e adaptar as suas necessidades metabólicas e/ou bioenergéticas dependendo do microambiente e de suas estratégias de sobrevivência. Portanto, entender melhor o perfil metabólico e energético adotado por células sensíveis e resistentes à CDDP pode auxiliar na identificação de proteínas e vias celulares ativadas na sobrevivência celular durante a quimioterapia. Nesse trabalho, foram desenvolvidas sublinhagens celulares com resistência adquirida à CDDP (A549-RA), a partir da linhagem parental de adenocarcinoma de pulmão A549. As células A549-RA foram desenvolvidas a partir da exposição das células parentais a concentrações crescentes de CDDP (0,1-0,5 μM). Após, foram estudados parâmetros metabólicos e bioenergéticos das células sensíveis e resistentes à CDDP. O efeito de moléculas e substratos no crescimento celular foi analisado por ensaio clonogênico ou de proliferação celular. Análises de respirometria de alta resolução foram realizadas em OROBOROS Oxygraph-2K. As células A549-RA apresentaram valor médio de GI50 (concentração de cisplatina necessária para inibição de 50% do crescimento) de ~3 μM, enquanto as células A549 apresentaram GI50 de 0,4 μM. Os níveis de resistência apresentados sugerem que os modelos celulares gerados são clinicamente relevantes, pois apresentam valores de GI50 8 vezes maiores do que aqueles das células sensíveis, resultado semelhante ao encontrado em células de pacientes após o tratamento quimioterápico. As células A549 apresentaram maior taxa de crescimento quando comparadas com as células A549-RA na ausência de CDDP. Porém, na presença da droga as células A549 perdem essa vantagem proliferativa, enquanto o crescimento das células A549-RA não é afetado. As células não tiveram o seu crescimento afetado pela presença de moléculas antioxidantes, sugerindo que espécies reativas de oxigênio não estão interferindo no seu crescimento. As linhagens não apresentaram diferença entre si quando a dependência de glutamina, sendo ambas dependentes deste aminoácido. As células A549-RA se mostraram mais sensíveis à privação de glicose do que as células A549. Os dados de respirometria indicaram um perfil bioenergético semelhante entre as células sensíveis e resistentes à CDDP, com maior consumo de oxigênio residual nas células A549-RA. Dessa forma, os dados indicam que as células A549-RA adaptaram o seu metabolismo ao ambiente citotóxico adotando um trade-off de crescimento lento não associado ao estresse oxidativo. A maior dependência de glicose e a similaridade nos parâmetros de respiração mitocondrial permitem propor um aumento na glicólise para obtenção de energia pelas células A549-RA.

Lung cancer is the second most prevalent cancer in the world and the leading cause of death. The main treatment for lung cancer patients is chemotherapy using drugs such as cisplatin (CDDP). However, the high incidence of tumor CDDP-resistance limits treatment success. Several studies have used cell lines for the understanding of molecular mechanisms involved in cancer CDDP-resistance. Tumor cells can change and adapt their metabolic and/or bioenergetic needs depending on the microenvironment and its survival strategies. Therefore, a better understanding of the metabolic and energetic profile adopted by CDDP-sensitive and resistant cells may aid in the identification of proteins and metabolic pathways involved in cell survival during chemotherapy. In this study, lung cancer subline with acquired CDDPresistance (A549-RA) was developed from the parental cell line A549. A549-RA cells were grown from exposure of the parental cells to increasing concentrations of CDDP (0.1-0.5 μM). Afterwards, metabolic and bioenergetic parameters of CDDP-sensitive and resistant cells were studied. The effect of molecules and substrates on cell growth was analyzed by clonogenic or cell proliferation assay. High-resolution respirometry analyzes were performed on OROBOROS Oxygraph-2K. A549-RA cells have shown mean GI50 (cisplatin concentration required for 50% growth inhibition) of ~ 3 μM whereas A549 cells had a GI50 of 0.4 μM. The resistance levels presented suggest that the cellular model developed is clinically relevant, since it presents GI50 values 8 times higher than those of the sensitive cells, a result similar to that found in patients' cells after chemotherapy treatment. A549 cells had a higher growth rate when compared to A549-RA cells in the absence of CDDP. However, in the presence of the drug, A549 cells lose this proliferative advantage, whereas the growth of A549-RA cells is not affected. The cells did not have their growth affected by the presence of antioxidant molecules, suggesting that reactive oxygen species are not interfering on their growth. The cell lines showed no difference on glutamine dependence between them, both being dependent on this amino acid. A549-RA cells were shown to be more sensitive to glucose deprivation than A549 cells. The respirometry data indicated a similar bioenergetic profile between A549 and A549-RA cell lines, with higher residual oxygen consumption in A549-RA cells. Thus, the data indicate that A549-RA cells adapted their metabolism to the cytotoxic environment adopting a slow-growing trade-off not associated with oxidative stress. The higher glucose dependence and similarity in mitochondrial respiration parameters allow us to propose an increase in glycolysis to obtain energy by A549-RA cells.