Adaptação e avaliação da técnica de citometria de fluxo para detecção de corpos de Heinz

Abstract

INTRODUÇÃO: Corpos de Heinz são inclusões presentes nos eritrócitos, resultado de hemoglobinas instáveis e podem estar presentes em amostras de pacientes portadores de hemoglobinopatias. O método usado atualmente utiliza microscopia óptica, é pouco sensível e raramente utilizado. O composto acetilfenilhidrazina induz a produção de corpos de Heinz fluorescentes. O objetivo deste trabalho foi adaptar e avaliar a técnica de citometria de fluxo para detectar os corpos de Heinz induzidos in vitro por acetilfenilhidrazina. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram utilizadas amostras de sangue de controles normais, alfa-talassêmicos e portadores de síndromes falciformes que foram incubadas com acetilfenilhidrazina e analisadas por citometria de fluxo. As emissões médias de fluorescência (mean fluorescence intensity – MFI) foram comparadas com os resultados obtidos na eletroforese de hemoglobina e no hemograma. RESULTADOS: Foram padronizadas a estabilidade das amostras e a quantidade de amostra necessária para a realização da técnica. Dentre os índices hematológicos, houve correlação positiva entre MFI e VCM, HCM e CHCM. Os pacientes portadores de síndromes falciformes obtiveram emissões médias de fluorescência significativamente mais altas que os controles e os alfa-talassêmicos e houve correlação positiva entre o aumento da emissão de fluorescência e a presença de HbS. Para os alfa-talassêmicos, não foi encontrada diferença significativa na emissão de fluorescência com relação aos controles normais. CONCLUSÃO: Foi possível padronizar a técnica de citometria de fluxo para detecção dos corpos de Heinz induzidos por acetilfenilhidrazina em pacientes alfa-talassêmicos e portadores de síndromes falciformes. Futuras análises precisam esclarecer a correlacão entre a produção de corpos de Heinz e a severidade de crises oxidativas em pacientes alfatalassêmicos e a relação entre a emissão média de fluosrescência obtida na citometria com o mecanismo de formação de corpos de Heinz pela acetilfenilhidrazina.

INTRODUCTION: Heinz bodies are inclusions present in red blood cells, which is the result of precipitated unstable hemoglobins. It can be found in samples of patientes who have hemoglobinopathies. The currently method for Heinz bodies visualization use optical microscopes which has lack of sensitivity and is rarely used. The compound acetylphenylhydrazine induce the production of fluorescents Heinz bodies. The main aim of the current study was to evaluate and adapt the flow cytometry technique to detect the fluorescent Heinz bodies induced in vitro by acetylphenylhydrazine. METHODS: Whole blood-samples from normal controls, patients with alpha thalassemia and syckle cell disease were incubated with acetylphenylhydrazine and examined by flow cytometry. The mean fluorescence intensity (MFI) was compared with the results of hemogram and hemoglobin eletrophoresis. RESULTS: It was standardize the stability and the amount of sample needed to perform this technique. Amongst the hematologic parameters, it was found positive correlation between MFI and VCM, HCM and CHCM. The patients with syckle cell disease had significantly higher MFI than controls and alpha thalassemic patients. Also, we found positive correlation between MFI and HbS. In the alpha thalassemia group, no significantly difference in MFI was found when compared to control samples. CONCLUSION: It was possible to detect fluorescent Heinz bodies induced by acetylphenylhydrazine by flow cytometry in alpha thalassemic and sickle cell disease patients. Further analyses are necessary to evaluate the correlation between Heinz bodies and the severity of oxidative crisis in alpha thalassemic patients and between MFI with the mechanism of Heinz bodies production by acetylphenylhydrazine.