HAND2 : um alvo na susceptibilidade à embriopatia da talidomida

Abstract

A talidomida foi um marco na teratologia, mas ainda não se conhecem por completo os mecanismos que dão origem à embriopatia da talidomida (TE). A TE é caracterizada por um conjunto de malformações que envolvem principalmente membros, coração, olhos e orelhas. Embora seja um dos mais potentes teratógenos, nem todos os bebês expostos à talidomida apresentam malformações, sendo a constituição genética um dos fatores que influenciam o aparecimento das anomalias. Recentemente, um estudo observou a presença de uma nova ligação entre a talidomida e T-box 5 (TBX5), além de uma forte interação entre Heart and Neural Crest Derivatives 2 (HAND2) e TBX5, sendo que essa interação foi perturbada na presença de talidomida. HAND2 é um fator de transcrição envolvido no desenvolvimento, principalmente, do coração e membros, e é codificado pelo gene HAND2 o qual possui dois éxons e está localizado no cromossomo 4. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do gene HAND2 na susceptibilidade genética à TE. Extraiu-se o DNA de amostras de saliva de 35 indivíduos portadores da TE e realizou-se a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação e sequenciamento das regiões de interesse do gene HAND2. As análises in silico foram realizadas para inferir o impacto das variantes na proteína. Os programas PredictSNP2 e MutationTaster foram utilizados para predições de efeito das variantes na proteína; Human Splicing Finder para sítios de splicing; miRBase para sítios de miRNA; MethPrimer para alterações em ilhas CpG; Enhancer Atlas 2.0 para sítios de reforçadores; e pacote de R motifbreakR para alterações em sítio de fatores de transcrição. As análises estatísticas foram executadas utilizando o software SPSS v 18. Dentre os indivíduos avaliados, todos apresentaram anomalias de membros, sendo 96% de membro superior e 48% de inferior. Além disso, 12% apresentaram anomalias congênitas cardíacas e 52% apresentaram efeitos tardios cardíacos. Foi identificada uma variante polimórfica sinônima p.P51 (rs59621536) no éxon 1 e nenhuma variante no éxon 2. A variante p.P51 esteve presente em três indivíduos dentre os 31 analisados para o éxon 1. As frequências genotípicas e alélicas foram diferentes entre o grupo TE e a amostra de referência (banco de dados GnomAD) (p=0,005; p=0,003, respectivamente). Nas análises in silico, a variante foi classificada como neutra, sem alteração em sítios de splicing e sítios de miRNA, estando localizada também na região promotora de HAND2-AS1. Foi indicada alteração de duas ilhas CpG adjacentes à variante, juntamente com alteração dos sítios de ligação de MECP2 (proteína ligadora de CpG-metil 2) e PLAG1 (proteína do gene de adenoma pleomórfico 1). A variante p.P51 apesar de não ter sido relacionada com alterações a nível proteico neste estudo, levou a alteração de duas ilhas CpG, além de modificar o sítio de ligação de MECP2, uma proteína importante na regulação de sequências metiladas. Dessa forma, p.P51 pode atuar modificando a regulação do gene HAND2 a nível epigenético. HAND2, por atuar no desenvolvimento de membros e coração, pode estar envolvido nos mecanismos de teratogênese da talidomida representando uma conexão entre as malformações de membros e coração observadas.

Thalidomide has been a milestone in modern teratology, but the mechanisms that give rise to thalidomide embryopathy (TE) are not yet fully understood. The TE is characterized by a set of malformations that mainly involve limbs, heart, eyes and ears. Although it is one of the most powerful teratogens, not all babies exposed to thalidomide present malformations and the genetic constitution is one of the factors that influence the arise of the anomalies. Recently, a study has observed the presence of a new link between thalidomide and T-box 5 (TBX5), in addition to a strong interaction between Heart and Neural Crest Derivatives 2 (HAND2) and TBX5, and this interaction was disturbed in the presence of thalidomide. HAND2 is a transcription factor involved in the development, mainly, of the heart and limbs, and is encoded by the HAND2 gene which has two exons and is located on chromosome 4. The aim of this work was to evaluate the role of HAND2 gene in the genetic susceptibility to TE. DNA was extracted from saliva samples from 35 individuals with TE and polymerase chain reaction (PCR) technique was used for amplification and sequencing of the regions of interest of HAND2 gene. In silico analyzes were performed to infer the impact of the variants on the protein. The PredictSNP2 and MutationTaster programs were used for effect predictions; Human Splicing Finder for splicing sites; miRBase for miRNA sites; MethPrimer for changes in CpG islands; Enhancer Atlas 2.0 for enhancer sites; and R package motifbreakR for site changes in transcription factors. Statistical analyzes were performed using SPSS v 18 software. Among the individuals evaluated, all presented limb anomalies, being that 96% of them had upper limb anomalies and 48% had lower limb anomalies. Moreover, 12% presented cardiac congenital anomalies and 52% had late cardiac effects. It was identified a synonymous polymorphic variant (p.P51) in exon 1 and no variant in exon 2. The p.P51 variant was present in three individuals among the 31 analyzed for exon 1. The genotypic and allelic frequencies were different between the group TE and the reference sample (GnomAD database) (p = 0.005, p = 0.003, respectively). In the in silico analyzes the variant was classified as neutral, without alteration in splicing sites and miRNA sites, being also located in the promoter region of HAND2-AS1. Alteration of two CpG islands adjacent to the variant was indicated along with alteration of the binding sites of MECP2 (Methyl-CpG binding protein 2) and PLAG1 (pleomorphic adenoma gene 1). The p.P51 variant, although not related to protein changes in this study, led to the alteration of two CpG islands, in addition to modifying the binding site of MECP2, an important protein in the regulation of methylated sequences. Thus, p.P51 can act by modifying the regulation of the HAND2 gene at the epigenetic level. HAND2, for acting in the development of limbs and heart, may be involved in the mechanisms of teratogenesis of thalidomide representing a connection between the malformations of limbs and heart.