Caracterização bioquímica, estrutural e farmacológica de um novo inibidor de proteinases do tipo Bowman-Birk isolado de Canavalia ensiformis

Abstract

Na visão clássica do sistema renina-angiotensina (RAS), a angiotensina II (Ang II) é gerada pela ação da enzima conversora de angiotensina (ACE). Evidências recentes vêm sugerindo que possam existir vias alternativas de geração de Ang II no ambiente intracelular em determinadas condições patológicas. Nesses casos a principal enzima conversora de Ang II é a quimase. Em condições de hiperglicemia, produtos avançados de glicação podem ativar quimase, desviando toda a rota de geração de Ang II, causando hipertrofia e aumento de proliferação em células musculares lisas de vasos (VSMCs). Neste trabalho descrevemos a caracterização estrutural e farmacológica de uma nova molécula capaz de bloquear a quimase e uma série de eventos mediados por Ang II in vitro e in vivo. A molécula capaz de inibir quimase foi isolada das sementes de Canavalia ensiformis, após precipitação com sulfato de amônio e métodos de cromatografia de troca aniônica e afinidade em coluna de tripsinasepharose. A estrutura do peptídeo isolado foi caracterizada por espectrometria de massas e métodos de modelagem molecular. O processo de inibição foi caracterizado com substrato sintético cromogênico para quimase e tripsina. As alterações vasculares foram estudadas in vivo em modelo de permeabilidade vascular em ratos e in vitro em cultura de células da musculatura lisa de aorta (linhagem A7r5-VSMCs). A nova molécula (denominada CETI) possui massa molecular de 8.173 dáltons, é um trímero em solução aquosa, a estrutura é rica em cisteínas, resistente às variações de temperatura e pH e apresenta duas alças inibitórias, uma capaz de inibir tripsina (IC50 21,68 nM) e outra capaz bloquear quimase (IC50 13,80 nM). É um inibidor competitivo de quimase e não-competitivo de tripsina. CETI bloqueia a geração de Ang II mediada por quimase humana e a atividade tipo-quimase de mastócitos isolados do peritônio de ratos. Também reduz a permeabilidade vascular induzida por um degranulador de mastócitos (composto 48/80) in vivo. VSMCs cultivadas em meio hiperglicêmico (glicose 25 mM) apresentam um aumento na geração intracelular de Ang II que é reduzida após o tratamento prévio com CETI. O inibidor também atenua uma série de eventos mediados por Ang II em VSMCs, tais como migração, proliferação e geração de espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho descrevemos a caracterização inédita de uma molécula capaz de bloquear uma via não-clássica do RAS, tendo, possivelmente aplicação terapêutica promissora em desordens vasculares.

In the classical view of the renin-angiotensin system (RAS), angiotensin II (Ang II) is generated by the action of angiotensin converting enzyme (ACE). Recent evidence suggests that there are alternatives for the generation of Ang II in the intracellular environment under pathological conditions. In such cases, the major Ang II converting enzyme is a chymase. Under conditions of hyperglycemia, advanced glycation products can activate chymase, disable the entire ang II generation pathway, cause hypertrophy, and increase vessel smooth muscle cell proliferation (VSMCs). In this workr, we described the structural and pharmacological characterization of a novel molecule able to blocking chymase and a series of Ang II-mediated events in vitro and in vivo. A molecule able of inhibiting chymase and trypsin was isolated from Canavalia ensiformes seeds after ammonium sulfate precipitation, anion exchange chromatography and affinity chromatography in trypsin-sepharose column. The isolated peptide structure was characterized by mass spectrometry and molecular modeling methods. The inhibition process was characterized with chromogenic synthetic substrates for chymase and trypsin. Vascular changes were also studied in vivo by rat vascular permeability model and in vitro with the aortic smooth muscle cells in culture (A7r5-VSMCs). The new molecule (named as CETI) has a molecular mass of 8,173 Daltons, is a trimer in solution, its structure is rich in cysteines, resistant to temperature and pH variations and has two inhibitory loops, one being able to inhibit trypsin (IC50 21.68 nM), and another able to block chymase (IC50 13.80 nM). It is a competitive chymase inhibitor and noncompetitive inhibitor of trypsin. CETI blocks human chymase mediated-Ang II generation and chymase-like activity of mast cells isolated from rat peritoneum. It also reduces vascular permeability induced by a mast cell degranulator (compound 48/80) in vivo. VSMCs cultured in hyperglycemic medium (25 mM glucose) show an increase in intracellular Ang II generation which is attenuated after prior treatment with CETI. The inhibitor also attenuates a number of Ang II-mediated events in VSMCs, such as migration, proliferation, and generation of reactive oxygen species. In this work, we describe for the first the characterization of a molecule able to block a non-classical RAS pathway, possibly having promising therapeutic application in vascular disorders.