Uso de Bacteriófagos Recombinantes para Detecção Rápida de Escherichia coli O157:H7 e Salmonella spp. em Alimentos

Abstract

Escherichia coli O157:H7 e Salmonella spp. são dois dos mais importantes microrganismos causadores de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) no mundo. Nos últimos anos, o Brasil vem liderando as exportações mundiais de carne bovina e avícola, alimentos que podem ser veículos destes patógenos. Antes da exportação, esses alimentos devem ser testados para garantir a ausência dos microrganismos citados e, quanto menor for o tempo de análise, maior é a vantagem competitiva das empresas exportadoras. Neste estudo, foram avaliados dois novos ensaios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em alimentos. PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay são métodos baseados no uso de bacteriófagos recombinantes, capazes de detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em tempos menores que outros métodos. Até o presente estudo, esses kits não haviam sido testados para a detecção de cepas brasileiras. Logo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a especificidade, limite de detecção e sensibilidade dos kits PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay em detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil. Primeiramente, realizou-se o teste de inclusividade com 55 isolados de Salmonella spp. e 14 isolados de E. coli O157:H7. Em seguida, foi determinado o limite de detecção in vitro dos kits. Para isto, três concentrações diferentes (1, 10 e 100 UFC/poço de microplaca) dos microrganismos avaliados foram submetidas a 2 h de infecção fágica a 37 ºC. A terceira etapa deste trabalho foi determinar o limite de detecção dos kits em alimentos. Para o kit PhageDx Salmonella Assay, inoculou-se 1 mL do coquetel de Salmonella spp. (concentrações de 1, 10 e 100 UFC) em 25 g de alface, peito de frango, salsicha de frango, patê de frango e nuggets. Em seguida, as amostras foram acrescidas de 75 mL de água peptonada tamponada e enriquecidas a 41 º C por 7 h antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Utilizando a mesma metodologia mencionada acima, testou-se o kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay. Neste teste, 1 mL do coquetel de E. coli O157:H7 nas mesmas concentrações, foi adicionado a 25 g de carne moída e alface, e a 25 mL de leite pasteurizado e água mineral. Posteriormente, caldo triptona de soja foi adicionado às amostras e a mistura foi incubada por 5 h a 41 º C antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Além disso, o PhageDx E. coli O157:H7 Assay teve seu desempenho comparado a um kit de PCR em tempo real para pesquisa de E. coli O157:H7 e Escherichia coli enterohemorrágicas, respectivamente, em carcaças bovinas. Com relação aos resultados obtidos, verificou-se que todos os isolados testados foram identificados pelo seu respectivo kit e o limite de detecção in vitro foi de 100 UFC/poço, em apenas 2 h, ou seja, sem enriquecimento das amostras. Os kits também foram capazes de detectar 1 UFC dos patógenos em 25 g (ou 25 mL) de alimentos, após 5 e 7 horas de enriquecimento, para E. coli O157:H7 e Salmonella spp., respectivamente. Apenas a detecção de Salmonella spp. em alface apresentou um limite de detecção ligeiramente superior aos demais alimentos, isso é, 10 UFC/25 g. O kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay não detectou a presença E. coli O157:H7 em nenhuma das 100 carcaças bovinas avaliadas. Em concordância com este resultado, o kit de PCR em tempo real não detectou a presença de E. coli enterohemorrágica. Os ensaios avaliados demonstraram ser satisfatórios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil, apresentando sensibilidade, especificidade e rapidez ao avaliarem diferentes matrizes alimentares. A detecção de uma única célula de Salmonella spp. em 25 g de amostra, após aproximadamente 9 h de ensaio, representa uma redução significativa de tempo em comparação aos métodos tradicionais e rápidos disponíveis atualmente no mercado. O mesmo foi observado para o kit de Escherichia coli O157:H7, cujo tempo de análise foi de cerca de 7 h. Além disso, os kits demonstraram ser fáceis de executar, tornando-os ferramentas promissoras para a detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em diferentes alimentos.

Escherichia coli O157:H7 and Salmonella spp. are two of the most important microorganisms causing Foodborne Diseases (FD) in the world. In recent years, Brazil has been leading world exports of beef and poultry, foods that can be vehicles for these pathogens. Before exportation, these foods must be tested to ensure the absence of the microorganisms cited, and the shorter the time of analysis, the greater the competitive advantage of exporting companies. In this study, two new assays for detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in food were evaluated. PhageDx E. coli O157:H7 Assay and PhageDx Salmonella Assay are methods consisting of recombinant bacteriophages, capable of detecting E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in shorter times than other methods. Until the present study, these kits had not been tested for the detection of Brazilian strains. Therefore, the objective of this study was to evaluate the specificity, limit of detection and sensitivity of PhageDx E. coli O157:H7 Assay and PhageDx Salmonella Assay in detecting E. coli O157:H7 and Salmonella spp. isolated in Brazil. First, an inclusivity test was performed with 55 isolates of Salmonella spp. and 14 isolates of E. coli O157:H7. Next, the in vitro detection limit of the kits was determined. For this, three different concentrations (1, 10 and 100 CFU/microplate well) of the evaluated microorganisms were submitted to 2 h of phage infection at 37 ºC. The third step of this work was to determine the detection limit of the kits in food. For the PhageDx Salmonella Assay kit, 1 mL of the Salmonella spp. (concentrations of 1, 10, and 100 CFU) was inoculated into 25 g of lettuce, chicken breast, chicken sausage, chicken pâté, and nuggets. The samples were then added to 75 mL of buffered peptone water and enriched at 41 °C for 7 h before being submitted to 2 h of phage infection at 37 °C. Using the same methodology as mentioned above, the PhageDx E. coli O157:H7 Assay kit was tested. In this test, 1 mL of the E. coli O157:H7 cocktail at the same concentrations was added to 25 g of ground beef and lettuce, and to 25 mL of pasteurized milk and mineral water. Subsequently, tryptone soy broth was added to the samples and the mixture was incubated for 5 h at 41 ºC before being submitted to 2 h of phage infection at 37 ºC. In addition, the PhageDx E. coli O157:H7 Assay performance was compared to a real-time PCR kit to screen for E. coli O157:H7 in bovine carcasses. Regarding the results obtained, it was verified that all isolates tested were identified by their respective kit and the in vitro detection limit was 100 CFU/well, in only 2 h, that is, without enrichment of the samples. The kits were also capable of detecting 1 CFU of the pathogens in 25 g (or 25 mL) of food, after 5 and 7 hours of enrichment, for E. coli O157:H7 and Salmonella spp., respectively. Only the detection of Salmonella spp. in lettuce had a slightly higher detection limit than the other foods, i.e. 10 CFU/25 g. The PhageDx E. coli O157:H7 Assay kit did not detect the presence of E. coli O157:H7 in any of the 100 bovine carcasses evaluated. In agreement with this result, the real-time PCR kit did not detect the presence of enterohemorrhagic E. coli. The assays evaluated proved to be satisfactory for detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. isolated in Brazil, showing sensitivity, specificity and rapidity in evaluating different food matrices. The detection of a single Salmonella spp. cell in 25 g of sample, after approximately 9 h of assay, represents a significant reduction in time compared to traditional and rapid methods currently available on the market. The same was observed for the Escherichia coli O157:H7 kit, whose analysis time was about 7 h. In addition, the kits proved to be easy to perform, making them promising tools for the detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in different foods.